在污水處理過程中，碳源作為微生物新陳代謝的必需物質和能量來源，對系統(tǒng)內各種污染物(氮、磷)的去除和污泥性能(吸附性能、沉降性能)有著非常重要的影響。由于雨水、河水、地下水的滲透稀釋，我國5476座城鎮(zhèn)污水處理廠中有2052座(數(shù)量占比37.5%)的進水耗氧有機污染物濃度(以COD計)小于150mg·L−1，與設計進水水質相差甚遠。特別地，南方地區(qū)多個城鎮(zhèn)污水處理廠的BOD5實際進水值比設計進水低，為設計值的1/2~1/3倍。除此以外，對廣東省60多座污水處理廠調查發(fā)現(xiàn)，40多座污水處理廠存在進水耗氧有機物濃度(以COD計)偏低的現(xiàn)象，其中23座污水廠進水COD值小于100mg·L−1，10座污水廠進水COD值小于60mg·L−1。可見，我國南方地區(qū)污水處理廠低濃度進水現(xiàn)象較為普遍。低濃度污水往往需外加碳源來保證脫氮，增加了處理成本，同時會使絲狀菌生長速率超過菌膠團細菌，容易引發(fā)污泥膨脹，增加污水處理難度。
在現(xiàn)有的污水處理工藝中，循環(huán)式活性污泥法(cyclicactivatedsludgesystem，CASS)能很好地處理低濃度污水，出水水質穩(wěn)定達標。CASS工藝是序批式活性污泥法的改良工藝，通常功能區(qū)分為污泥選擇區(qū)和主反應區(qū)，體積比為1∶5，污泥選擇區(qū)進行反硝化脫氮和厭氧釋磷，主反應區(qū)進行硝化和好氧聚磷。該工藝具有反應器配置靈活、操作簡便、污泥絲狀膨脹少和占地面積小等優(yōu)點，已廣泛應用于處理城市污水、工業(yè)廢水和農(nóng)村生活污水等。在處理低濃度污水時，通過梯級非限制曝氣等方式，能有效緩解反硝化碳源不足的問題，促進同步硝化反硝化，在出水達標的前提下顯著增強脫氮效率。同時CASS工藝前端的污泥選擇區(qū)能有效抑制污泥絲狀膨脹，活性污泥體積指數(shù)一般較低(20~40mg·L−1)，污泥沉降性能良好。
盡管CASS工藝對低濃度進水有良好的適應性，但當進水濃度過低時，會對其沿程污染物降解特征和微生物群落響應機制造成顯著影響。有研究表明，當進水COD值為98mg·L−1時，耗氧有機物濃度(以COD計)在進水曝氣0.5h大幅降低，隨后微生物以內源呼吸為主，細胞衰亡釋放代謝產(chǎn)物造成水體有機物濃度緩慢升高，有機物、氨氮、總氮和總磷的去除主要發(fā)生在運行前期，曝氣結束后污染物濃度基本不變，曝氣階段主反應區(qū)變形菌門的相對豐度最高，污染物濃度變化的主要原因是由于活性污泥與污水接觸初期具有快速吸附的性能，吸附作用通常在5~15min內完成。污染物去除與微生物群落結構變化密切相關，這些沿程變化的特征必然會引起微生物群落結構的沿程差異；同時，進料方式的改變會富集不同的脫氮功能菌，當進水COD值為150mg·L−1時，序批式進料生化池的硝化螺旋菌屬和黃桿菌屬豐度較高，而連續(xù)式進料的硝化菌屬和脫氯單胞菌屬豐度較高。可見，對于CASS工藝，微生物的群落特征與污水處理性能密切相關。然而，現(xiàn)有研究大多集中在反應器的整體微生物變化，鮮有涉及沿程(分區(qū)、分階段)微生物群落結構變化方面的研究。而揭示低進水濃度下CASS工藝微生物群落結構的沿程變化特征，是了解污染物降解沿程變化過程機理的關鍵。
因此，本研究選取廣東省某CASS工藝城鎮(zhèn)污水處理廠作為研究對象，統(tǒng)計歷年運行數(shù)據(jù)，分析工藝處理效果，沿程布點采集完整周期內不同的反應區(qū)域與運行階段的污水和污泥樣品，綜合研究CASS生化池沿程污染物變化與沿程微生物群落結構變化，從微生物學角度揭示低負荷CASS工藝的污水處理機理與運行機制，為長期處于低負荷進水條件CASS工藝的設計及運行優(yōu)化提供參考。
1、材料與方法
1.1 工程概況
廣東省某CASS城鎮(zhèn)污水廠處理規(guī)模為6×104m³·d−1。該污水廠未采取外加碳源與化學除磷劑的方式，出水執(zhí)行《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標準》(GB18918-2002)一級A排放標準。該污水廠預處理段由粗格柵、細格柵及旋流沉砂池組成，二級處理單元為CASS生化池，深度處理采用反硝化深床濾池和加氯消毒工藝。CASS生化池分為污泥選擇區(qū)和主反應區(qū)兩部分，體積比1∶5，有效水深6m，換水率30%，進水時污泥選擇區(qū)啟動潛流攪拌，主反應區(qū)啟動潛流攪拌和鼓風曝氣，完整1周期時長為4h，進水2h，沉淀1h，潷水40min，閑置20min。進水5min后開始污泥回流至進水結束，流量為130m3·h−1，回流比為18.8%。沉淀5min后開始排剩余污泥至沉淀結束，流量為20m3·h−1。水力停留時間為17.1h，污泥齡為15.1d，MLSS為4064~5615mg·L−1，MLVSS為1986~2969mg·L−1，SVI為28.9~39.9mg·L−1，曝氣時主反應區(qū)溶解氧為1~2mg·L−1。實驗時生化池內溫度為20~25℃。工藝流程如圖1所示，月均水質指標如表1所示。該廠月均進水COD值均小于150mg·L−1，屬于典型的低進水濃度污水處理廠。
1.2 沿程污染物變化實驗方法
采集不同區(qū)域與不同運行階段的污水樣品，采樣點分別布設在配水井出水、細格柵出水、旋流沉砂池出水、污泥選擇區(qū)中段(進水10min、進水1h、進水結束、沉淀1h、潷水結束、閑置結束)、主反應區(qū)出水段(進水10min、進水1h、進水結束、沉淀1h、潷水結束、閑置結束)，每個采樣點均分析化學需氧量(COD)、總氮(TN)、硝態(tài)氮(NO3−-N)、銨態(tài)氮(NH4+-N)、總磷(TP)水質指標，采集6次完整周期樣本，對每個指標重復測定3次取均值，對各污染物的沿程變化進行研究。
1.3 沿程微生物群落分析
采集CASS生化池污泥選擇區(qū)和主反應區(qū)不同運行階段(進水1h、進水結束、沉淀1h、閑置結束)的活性污泥樣品，用250mL塑料瓶儲存，置于−80℃的冰箱保存待測。樣品DNA使用PowerWater®SterivexTMDNAIsolationKit(MoBio,USA)試劑盒按說明書進行提取，使用Nanodrop(ThermoScientific,USA)檢測DNA濃度和純度，使用瓊脂糖凝膠電泳法檢測蛋白污染及DNA完整度。質檢合格的DNA樣品通過引物515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和907R(5’-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3’)對DNAV4~V5可變區(qū)進行擴增，條件為94℃預變形5min，94℃變形30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環(huán)，72℃延伸10min，每個樣品做3個重復。完成擴增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，每個擴增子的主帶長度均不小于420bp，按等質量原則計算樣品體積，將各PCR產(chǎn)物進行混合，在IlluminaNova6000平臺進行PE250測序，獲得的原始序列經(jīng)質控過濾后得到有效的高質量序列，采用UPARSE方法將有效序列進行OTU聚類，并與SILVA數(shù)據(jù)庫進行比對分析。
1.4 檢測及分析方法
水樣COD、BOD5、TN、TP、NH4+-N、NO3−-N、MLSS、MLVSS、SVI等指標均根據(jù)國家標準方法進行測定。溶解氧和溫度由雷磁DZB-718-A型便攜式多參數(shù)分析儀測定。
使用Origin2022軟件對理化數(shù)據(jù)與微生物相對豐度進行繪圖，利用STAMP軟件進行優(yōu)勢微生物差異分析。將OTU信息導入Excel2022，使用USEARCH軟件計算多樣性指數(shù)。使用TBtools軟件繪制微生物菌屬聚類熱圖。使用R軟件(版本4.2.2)vegan程序包對微生物菌屬和環(huán)境因子進行RDA冗余分析，ggplot2程序包進行繪圖。通過PICRUSt軟件對OTU豐度表進行標準化，比對KEGG數(shù)據(jù)庫信息進行功能基因預測分析。
2、結果與討論
2.1 沿程污染物變化特征
按照CASS工藝功能區(qū)劃分，通過對預處理段和生化池的沿程布點，分析COD、TN、NO3−-N、NH4+-N、TP污染物的沿程變化特征，研究各功能區(qū)不同運行階段的污染物去除性能。
1)耗氧有機物(以COD計)沿程變化分析。圖2揭示了預處理段、污泥選擇區(qū)和主反應區(qū)COD值變化特征。從配水井到旋流沉砂池通過物理作用去除污水中18.36%的耗氧有機物(以COD計)，進入生化池前初始的COD值為59.33mg·L−1，污水進入污泥選擇區(qū)后，進水10minCOD值迅速降低至32.33mg·L−1，主要原因是由于生物吸附，吸附一般進行5~15min后即達到飽和，該過程也存在回流液的混合稀釋。進水1h異養(yǎng)菌降解吸附的有機物，部分有機碳源用于脫氮除磷，COD值達到最低18.67mg·L−1。吸附飽和后活性污泥若未及時完成泥水分離，會重新釋放有機物至上覆水流，同時存在進水有機物補充，共同導致進水結束時COD值上升至21mg·L−1。進水結束至閑置結束污泥選擇區(qū)COD值持續(xù)上升至41.67mg·L−1，原因是進水有機物含量低，可生物利用組分很快被降解完，當水中有機物濃度過低時，微生物開始進行內源呼吸，部分細胞衰亡釋放代謝物到水中，導致COD值上升，同時可能存在部分固態(tài)有機物厭氧分解。
主反應區(qū)COD值變化不明顯，表明有機物的吸附降解主要發(fā)生在污泥選擇區(qū)。將旋流沉砂池出水與主反應區(qū)潷水結束的耗氧有機物濃度(以COD計)對比，CASS生化池可去除污水中56.42%的耗氧有機物(以COD計)，出水COD值為18.33mg·L−1。
2)氮素沿程變化分析。圖3(a)、圖3(b)、圖3(c)揭示了預處理段、污泥選擇區(qū)和主反應區(qū)TN、NH4+-N及NO3−-N質量濃度變化特征。經(jīng)細格柵和旋流沉砂池處理去除8.09%的TN與5.48%的NH4+-N，進入生化池初始的TN、NH4+-N及NO3−-N質量濃度分別為10.57、5.69、0.07mg·L−1。污泥選擇區(qū)進水階段TN變化情況與COD相似，進水10min主要發(fā)生吸附，進水1h主要進行反硝化脫氮，進水結束時TN質量濃度上升至7.14mg·L−1，主要由于進水補充、NO3−-N內回流和吸附的TN解吸導致，隨后階段主要以反硝化為主，閑置結束TN質量濃度降低至5.77mg·L−1。同樣，污泥選擇區(qū)NH4+-N質量濃度在進水1h降至最低值2.91mg·L−1。有研究表明，當溶解氧較低時硝化主要以短程硝化為主，由于內回流液中含有少量溶解氧，故該階段主要發(fā)生短程硝化導致NH4+-N質量濃度降低。沉淀過程底部溶解氧含量較低，厭氧條件下NH4+-N的釋放速率與釋放量比好氧條件下高，沉淀1h選擇區(qū)NH4+-N質量濃度上升至3.94mg·L−1。進水NO3−-N質量濃度幾乎為0mg·L−1，污泥選擇區(qū)的NO3−-N絕大部分來自主反應區(qū)內回流的NO3−-N，進水階段NO3−-N質量濃度始終低于主反應區(qū)，進水結束后NO3−-N質量濃度持續(xù)降低至0.69mg·L−1，說明選擇區(qū)沿程均存在反硝化脫氮。
主反應區(qū)TN質量濃度在進水曝氣1h降低至5.84mg·L−1，好氧硝化使NH4+-N質量濃度在進水結束時下降至最低值0.55mg·L−1，與選擇區(qū)沿程NH4+-N質量濃度維持在較高水平相比，表明NH4+-N的降解去除主要發(fā)生在主反應區(qū)，進水結束時NO3−-N上升至最高值4.47mg·L−1；進水結束后發(fā)生反硝化脫氮使TN降低，NH4+-N因含氮物質分解釋放而上升，與污泥選擇區(qū)沿程變化一致。潷水階段氧傳質增強，NO3−-N質量濃度上升至4mg·L−1，此時TN質量濃度降低至5.77mg·L−1，說明出現(xiàn)同步硝化反硝化脫氮現(xiàn)象。閑置階段主反應區(qū)NO3−-N質量濃度仍維持在較高水平，表明NO3−-N的去除主要發(fā)生在污泥選擇區(qū)。比較旋流沉砂池出水與主反應區(qū)潷水結束的TN與NH4+-N質量濃度可知，CASS生化池可去除41.71%的TN與77.78%的NH4+-N。以進水10min與閑置結束的TN質量濃度為始末值計算，污泥選擇區(qū)脫氮效率為23.23%，主反應區(qū)脫氮效率為8.80%，表明污泥選擇區(qū)具有更高的脫氮效能。
3)TP沿程變化分析。圖4揭示了預處理段、污泥選擇區(qū)和主反應區(qū)TP質量濃度變化特征。在預處理段通過物理作用去除污水TP效果不明顯，進入生化池初始的TP質量濃度為0.87mg·L−1。進水10min由于聚磷菌厭氧釋磷導致污泥選擇區(qū)的TP升至最高值1.1mg·L−1。進水1h由于從主反應區(qū)內回流的混合液中含有NO3−-N，聚磷菌能以NO3−-N作為電子受體替代氧進行生物除磷，使得污泥選擇區(qū)TP質量濃度顯著下降至最低值0.19mg·L−1。進水結束時生物吸附趨于飽和，部分有機磷分解釋放到水體中，伴有進水補充，TP質量濃度升高至0.31mg·L−1。
由于主反應區(qū)進水時曝氣充氧，聚磷菌超量吸磷，TP質量濃度顯著降低，沉淀1hTP質量濃度達到最低值0.06mg·L−1，該過程NO3−-N和TP同步降低，出現(xiàn)反硝化除磷現(xiàn)象。污泥選擇區(qū)與主反應區(qū)在進水結束后TP質量濃度基本不變，在活性污泥DNA檢測中發(fā)現(xiàn)兩個區(qū)域均存在藍藻菌，磷是藍藻生長的關鍵營養(yǎng)元素，說明維持出水TP質量濃度較低的原因除了聚磷菌好氧吸磷外還包括藍藻吸磷。對比兩個區(qū)域進水10min和進水1h的TP降低幅度可知，TP的去除主要發(fā)生在污泥選擇區(qū)。將旋流沉砂池出水與主反應區(qū)潷水結束的TP質量濃度進行對比，可知CASS生化池可去除99.59%的TP，出水TP質量濃度為0.063mg·L−1。
2.2 沿程微生物群落變化特征
1)微生物多樣性分析。基于OTU數(shù)據(jù)，從α多樣性特點綜合分析微生物多樣性，各功能區(qū)及其不同運行階段活性污泥的α多樣性指數(shù)如表2所示。8組樣品的覆蓋率指數(shù)均大于0.99，說明數(shù)據(jù)的可靠性非常高。微生物相對數(shù)量使用OTUs數(shù)值來評估，比較不同區(qū)域同一階段，污泥選擇區(qū)活性污泥的OTUs數(shù)值除進水1h較低外，其余階段均高于主反應區(qū)，污泥選擇區(qū)微生物總量普遍較多；從同一區(qū)域沿程變化看，污泥選擇區(qū)微生物數(shù)量在增多，主反應區(qū)的則先降低后升高，與沿程COD變化相似，原因是污水廠中大部分細菌群落與COD呈正相關關系。
Simpson、Shannon和Chao1指數(shù)分別反映微生物群落的多樣性、均一性和物種總數(shù)。Simpson指數(shù)顯示污泥選擇區(qū)沿程的微生物多樣性先升高后降低，主反應區(qū)的先降低后升高，結合沿程污染物變化特征和工藝設計推測，該結果是由于選擇區(qū)微生物前期吸附較多碳源，促進異養(yǎng)菌的生長使多樣性升高，后期自養(yǎng)菌占比大多樣性降低，主反應區(qū)進水階段曝氣充氧硝化細菌占比大多樣性降低，停止曝氣后該類菌豐度降低多樣性升高。根據(jù)Shannon指數(shù)，污泥選擇區(qū)沿程微生物均一性先降低后升高，主反應區(qū)的先升高后降低，表明污泥選擇區(qū)某些功能性微生物數(shù)量在運行初期增多，后期減少，主反應區(qū)則相反。進水1h時主反應區(qū)Shannon指數(shù)最低，可能是由于硝化菌在此時數(shù)量最多造成的。Chao1指數(shù)對稀有物種比較敏感，污泥選擇區(qū)的Chao1指數(shù)比主反應區(qū)高，2個區(qū)域沿程Chao1指數(shù)在升高，說明選擇區(qū)的稀有物種數(shù)目更豐富，沿程稀有物種增多。
2)門水平微生物分析。由圖5可知生化池的優(yōu)勢菌門(平均相對豐度>1%)有：Proteobacteria(變形菌門，58.47%)、Bacteroidetes(擬桿菌門，21.6%)、Chloroflexi(綠彎菌門，7.06%)、Planctomycetes(浮霉菌門，2.91%)、Patescibacteria(髕骨菌門，1.44%)、Elusimicrobia(迷蹤菌門，1.15%)、Cyanobacteria(藍藻菌門，1.07%)和Firmicutes(厚壁菌門，1.02%)。變形菌門是生化池中相對豐度最高的菌門(54.68%~61.87%)，在污泥選擇區(qū)豐度先上升后下降，主反應區(qū)則相反，該變化與微生物多樣性的變化一致，通常變形菌的生長速度快，代謝途徑廣，含有大多數(shù)反硝化菌，表明變形菌門是影響微生物多樣性變化的關鍵菌門，更易在低濃度污水中生存。主反應區(qū)的擬桿菌門平均相對豐度(22.69%)比污泥選擇區(qū)(20.51%)高，擬桿菌門主要參與有機物的降解，表明污泥選擇區(qū)吸附的有機物一部分在主反應區(qū)被降解。污泥選擇區(qū)的綠彎菌門平均相對豐度(7.51%)比主反應區(qū)(6.61%)高，綠彎菌門具有良好的除磷功能，表明磷的去除主要發(fā)生在選擇區(qū)，該結果也與沿程總磷變化特征相吻合。迷蹤菌門為兼養(yǎng)型微生物，可利用O2、NO3−-N或NO2−-N進行呼吸，其在主反應區(qū)的平均相對豐度(1.2%)較選擇區(qū)(1.11%)高。藍藻菌門能積累外源性磷，具有超量吸磷的作用，其在污泥選擇區(qū)的沿程相對豐度持續(xù)降低(1.11%~0.97%)，而在主反應區(qū)則持續(xù)升高(0.99%~1.26%)，其豐度變化與NO3−-N質量濃度沿程變化趨勢一致(見圖3c)，推測是由于兩個區(qū)域沿程的NO3−-N質量濃度變化影響藍藻菌的豐度變化。
3)屬水平微生物分析。為直觀地展現(xiàn)低進水濃度生化池不同功能區(qū)域的微生物菌屬沿程變化特征，在屬水平上對活性污泥樣品中豐度前30的菌屬繪制熱圖并進行聚類分析，如圖6所示。其中有6個優(yōu)勢菌屬(最大相對豐度>1%)，分別為Zoogloea(動膠菌屬)、Sulfuritalea(硫針菌屬)、Thauera(陶厄氏菌屬)、OM27_clade、UTCFX和Haliangium。污泥選擇區(qū)運行前期Zoogloea豐度最高(進水1h，57.18%)，沿程持續(xù)降低，而在主反應區(qū)運行末期其豐度最高(閑置結束，59.11%)，Zoogloea能分泌胞外聚合物形成微生物絮狀體，提高污泥沉降性能，同時其能通過在細胞內形成多聚偏磷酸鹽的方式吸收磷，表明選擇區(qū)在進水階段除磷能力較強，主反應區(qū)運行后期依靠該菌屬維持較低TP質量濃度，與總磷沿程變化特征一致。Sulfuritalea在有氧條件下能降解有機酸，污泥選擇區(qū)進水階段Sulfuritalea相對豐度最高(進水結束，2.8%)，主反應區(qū)進水階段其豐度逐漸降低(進水結束，2.56%)，隨后沿程豐度逐漸升高，在閑置結束達到最高(3.99%)，該結果進一步表明部分有機物的降解發(fā)生在主反應區(qū)。Thauera是一種反硝化聚磷菌，在低有機碳源條件具有競爭優(yōu)勢，其能夠使用硝酸鹽作為電子受體降解各種芳香族化合物和鹵代衍生物，同時可通過代謝羥基丁酸鹽積累磷酸鹽，該菌在去除有機物和脫氮除磷等方面均發(fā)揮作用，污泥選擇區(qū)進水1h時該菌屬豐度較高(1.55%)，促進選擇區(qū)進行反硝化除磷。Haliangium是一種典型的反硝化細菌，與水和土壤環(huán)境的氮循環(huán)相關，在污泥選擇區(qū)中不是優(yōu)勢菌屬，沿程豐度先降低后升高，在主反應區(qū)中則持續(xù)升高(閑置階段，1.42%)，表明其主要參與主反應區(qū)的脫氮。
在污泥選擇區(qū)沿程中，進水1h時Zoogloea、Aeromonas(氣單胞菌屬)、Fluviicoccus和Thauera豐度較高，其中Zoogloea具有除磷功能，Aeromonas與氨氧化、好氧反硝化有關，Thauera具有降解有機物與反硝化除磷功能，該階段主要發(fā)生有機物的降解，反硝化除磷和氨氧化；進水結束時SM1A02和Nitrospira(硝化螺旋菌屬)豐度較高，其中Nitrospira主導NO2−-N氧化，該階段NO2−-N氧化性能提高；沉淀1h時Flavobacterium、JdFR-76和Paludibacter豐度較高，Thauera的豐度進一步提高，表明該階段反硝化性能進一步提升；閑置結束時Polyangium、Prevotella_9(普雷沃氏菌屬)、Macellibacteroides、Candidatus_Accumulibacter、Bacteroides(擬桿菌屬)、Arcobacter(弓形菌屬)、Lactobacillus和Turneriella豐度較高，其中Prevotella_9是一類能強化人工濕地反硝化性能的菌屬，Bacteroides通常存在于厭氧環(huán)境中，是一種氫氧化型自養(yǎng)反硝化細菌，Arcobacter在低C/N比和低溫下具有較高的脫氮效率，Candidatus_Accumulibacter是典型的聚磷菌，Macellibacteroides可將蛋白質和多糖降解為各種有機酸。綜上表明，該階段脫氮菌類型多豐度高，脫氮性能進一步增強，同時存在聚磷菌厭氧釋磷和大分子有機物的降解，與沿程耗氧有機物、氮和磷的變化趨勢相對應。
在主反應區(qū)沿程中，進水1hNitrospira豐度較高，該階段主要發(fā)生NO2−-N氧化；進水結束時Terrimonas、Phaselicystis和Lactobacillus豐度較高，Terrimonas適宜在低負荷條件下進行反硝化脫氮，Lactobacillus可以降解碳水化合物，產(chǎn)生醋酸、乳酸和乙醇，表明該階段主要發(fā)生有機物的降解和反硝化脫氮；沉淀1h時Pirellula、Nitrosomonas(亞硝化單胞菌屬)和Leptospira豐度較高，Nitrosomonas主導氨氧化，說明該階段氨氧化性能提高，與此時NH4+-N質量濃度升高有關；閑置結束時Plasticicumulans、Pajaroellobacter、Sulfuritalea、Haliangium、Haliscomenobacter、OM27_clade、Polyangium、Flavobacterium、Crocinitomix和Zoogloea豐度較高，其中Sulfuritalea降解有機酸，Haliangium主要進行反硝化，Zoogloea具有除磷功能，故該階段進一步降解有機物和脫氮除磷。
為探究不同功能區(qū)域的顯著差異微生物菌屬，將2個區(qū)域豐度前30的微生物菌屬信息導入STAMP軟件，設置P=0.05過濾條件，輸出顯著差異菌屬，結果如圖7所示。由圖7可知，與主反應區(qū)相比，污泥選擇區(qū)的顯著優(yōu)勢菌屬為Aeromonas、Bacteroides、Paludibacter、Prevotella_9和Arcobacter，其中Paludibacter可以分解各種糖類，產(chǎn)生醋酸和丙酸作為反硝化的碳源，其余菌屬也均與脫氮相關，表明與主反應區(qū)相比，污泥選擇區(qū)主要依賴這5種菌屬進行脫氮。在主反應區(qū)中，顯著優(yōu)勢菌屬為Pajaroellobacter、Plasticicumulans和Sulfuritalea，Sulfuritalea主要降解有機酸，進一步表明部分有機物在主反應區(qū)被降解。
2.3 微生物群落與環(huán)境因子的相關性分析
環(huán)境因素是影響微生物群落結構的主要因素，本研究選取COD、NH4+-N、NO3−-N、TN和TP作為環(huán)境因子，結合沿程微生物群落結構變化，利用冗余分析(RDA)研究環(huán)境因子與微生物菌屬之間的相關性，如圖8所示。主軸1和主軸2的特征值分別為52.14%和23.46%，解釋了總方差的75.6%。在這些環(huán)境變量中NO3−-N的解釋度最高(38.92%)，對微生物群落結構的塑造影響最顯著，NO3−-N是污水處理廠生物脫氮的重要環(huán)境因素，結合NO3−-N沿程變化可知，其主要在污泥選擇區(qū)被去除，在主反應區(qū)的降解效率低、殘留質量濃度高，低濃度生化池主要反硝化菌為Thauera、Haliangium、Bacteroides、Arcobacter、Aeromonas和Prevotella_9，但其豐度占比低，平均豐度分別為1.45%、0.82%、0.48%、0.37%、0.3%和0.32%，反硝化菌數(shù)量占比低是限制污水廠脫氮的主要因素，其中Haliangium與TN呈負相關，Thauera、Bacteroides、Arcobacter、Aeromonas和Prevotella_9與NO3−-N呈負相關。NH4+-N和TP的貢獻率僅次于NO3−-N，分別位居第2和第3(17.51%和7.76%)。在低進水濃度CASS生化池中，觀察到NH4+-N與TP呈正相關，主要是由于好氧時硝化與聚磷同步發(fā)生，厭氧時含氮物質分解釋放NH4+-N同步聚磷菌釋磷的結果。Plasticicumulans和Sulfuritalea與COD呈負相關關系；Candidatus_Accumulibacter與TP呈正相關，受COD影響較大；Nitrospira與TN呈正相關。上述結果進一步佐證沿程功能性微生物具有降解有機物和脫氮除磷的能力，同時可為優(yōu)化調整工藝參數(shù)、富集各功能性微生物類群提供依據(jù)。
2.4 功能基因預測分析
為了獲得不同生化區(qū)域細菌的功能，采用PICRUSt軟件，根據(jù)KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫預測細菌群落的功能。如圖9所示，有6個功能基因組別，包括新陳代謝、人類疾病、細胞工程、生物體系統(tǒng)、遺傳信息加工和環(huán)境信息加工。根據(jù)KEGG功能分類，碳水化合物代謝、氨基酸代謝、輔因子和維生素代謝、萜類和聚酮化合物代謝、異生素降解和代謝、脂質代謝、能量代謝、細胞運輸以及遺傳信息復制和修飾為低濃度生化池中的主要功能基因，其相對豐度之和在污泥選擇區(qū)和主反應區(qū)分別為81.65%和81.57%，除其他次生代謝物的生物合成外，其余的基因豐度均是選擇區(qū)大于主反應區(qū)。相關研究表明，有機物的添加可顯著提高反硝化功能基因的活性，增加反硝化過程相關功能基因的數(shù)量，結合微生物多樣性分析，污泥選擇區(qū)大部分基因豐度比主反應區(qū)高的原因主要是選擇區(qū)的耗氧有機物(以COD計)濃度高，微生物數(shù)量多。
由RDA分析可知NO3−-N的解釋度最高，為了進一步研究氮代謝途徑，選擇了硝化代謝基因(pmoA/B/C-moA/B/C、hao、nxrA/B)和反硝化代謝基因(narG/H/I、napA/B、nirS/K、norB/C、nosZ)，污泥選擇區(qū)和主反應區(qū)分別標記為I和II(圖10)。在硝化途徑中，沉淀1h時主反應區(qū)氨和羥胺氧化功能基因豐度較高(pmoA/B/C-moA/B/C、hao)，表明此時硝化性能增強，結合沿程污染物的變化主要是由于NH4+-N質量濃度的升高促進了硝化反應，使該類功能基因豐度上升。主反應區(qū)沿程NO2−-N氧化功能基因豐度(nxrA/B)明顯比污泥選擇區(qū)高，短程硝化適宜的溶解氧質量濃度為0.5mg·L−1，當溶解氧為1~2mg·L−1時，NO2−-N積累率下降，主要進行全程硝化，生化池主反應區(qū)進水曝氣時溶解氧為1~2mg·L−1，主要以全程硝化為主，而污泥選擇區(qū)始終處于厭氧或缺氧狀態(tài)，主要以短程硝化為主，基因nxrA/B豐度低，結合沿程菌屬豐度變化可知兩個區(qū)域的Nitrospira(NOB)豐度差別并不大，說明溶解氧對NOB的豐度影響不大，主要是限制NOB對NO2−-N的氧化功能，該結果與先前的研究報道一致。從反硝化途徑看，污泥選擇區(qū)和主反應區(qū)沿程均在進行反硝化，除進水1h外，其余階段選擇區(qū)反硝化基因豐度均比主反應區(qū)高，佐證污泥選擇區(qū)具有較高的脫氮效率。
3、結論
1)根據(jù)低進水濃度CASS生化池沿程污染物變化特征，可知耗氧有機物(以COD計)、TN、NO3−-N、TP主要在污泥選擇區(qū)被吸附降解，NH4+-N主要在主反應區(qū)被降解。污泥選擇區(qū)進水1hCOD和TP值降至最低，由于進水補充、厭氧大分子有機物分解釋放和聚磷菌釋磷，隨后其沿程均有所上升，進水階段NO3−-N質量濃度始終低于主反應區(qū)，進水結束后沿程NO3−-N質量濃度持續(xù)下降；主反應區(qū)進水階段NH4+-N質量濃度顯著降低。表明污泥選擇區(qū)主要去除有機物和完成反硝化脫氮和除磷，主反應區(qū)主要進行硝化脫氨。總體而言，生化池可去除低濃度污水中56.42%的耗氧有機物(以COD計)、41.71%的TN、77.78%的NH4+-N、99.59%的TP。
2)沿程微生物變化特征結果表明，生化池的優(yōu)勢菌門有變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、髕骨菌門、迷蹤菌門、藍藻菌門和厚壁菌門，污泥選擇區(qū)微生物總量較主反應區(qū)多，變形菌門是影響微生物多樣性變化的關鍵菌門。屬水平上，污泥選擇區(qū)進水1hZoogloea、Aeromonas和Thauera豐度較高，除磷、氨氧化和反硝化性能較強；進水結束Nitrospira豐度較高；沉淀1hThauera的豐度提高，反硝化性能提升；閑置結束Prevotella_9、Bacteroides、Arcobacter、Macellibacteroides和Candidatus_Accumulibacter豐度較高，脫氮菌類型多豐度高，脫氮性能提高，同時存在大分子有機物的分解釋放和聚磷菌厭氧釋磷。主反應區(qū)進水1hNitrospira豐度較高，主要發(fā)生硝化NO3−-N質量濃度上升；進水結束Terrimonas和Lactobacillus豐度較高，該過程以反硝化和有機物降解為主；沉淀1hNitrosomonas豐度較高，主要發(fā)生氨氧化；閑置結束Sulfuritalea、Haliangium、Zoogloea豐度較高，該階段同步進行有機物降解、反硝化脫氮和除磷。
3)沿程功能性微生物豐度變化與污染物濃度變化相對應，NO3−-N對微生物群落結構的塑造影響最顯著(解釋度為38.92%)。整體功能基因豐度污泥選擇區(qū)大于主反應區(qū)，氮代謝途徑表明沿程主反應區(qū)均發(fā)生全程硝化反硝化，選擇區(qū)均發(fā)生短程硝化和全程反硝化。除進水1h外，其余階段選擇區(qū)的反硝化功能基因豐度均比主反應區(qū)高。（來源：華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，廣東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村污染治理與環(huán)境安全重點實驗室）
