據統計，2021年，全球葡萄種植面積達到734×104hm2，葡萄酒產量超過2500×107L。葡萄酒生產過程中產生的有機廢水主要來源于加工設備的清洗和殘液的排出，這些廢水中含有大量由醇、糖和有機酸組成的溶解性有機物、微量營養素、多酚類化合物。受葡萄生長周期的影響，在9-11月，葡萄酒釀制高峰期所產生的廢水量及廢水中的有機物濃度增加明顯。綜上，葡萄酒生產廢水總體呈酸性，色度和有機物濃度高，可生化性好，但水質、水量季節性波動明顯。
厭氧消化作為一種能高效降解有機質的技術，被廣泛用于葡萄酒生產廢水的預處理過程。厭氧序批式生物膜反應器(AnSBBR)兼備生物膜法、序批式反應器的優點。生物膜法通過載體富集微生物，從而增加了反應器中生物質的濃度和多樣性，提高了系統的抗沖擊能力。序批式工藝不僅自動化程度高，還存在周期性循環和完全混合的特性，從而提高了抗沖擊能力。目前，AnSBBR優異的處理性能和抗沖擊能力已在生物柴油、甘油和金屬加工等多種廢水的處理研究中得以證實，但其對葡萄酒生產廢水的處理負荷和消化性能尚不明確。
通常，較低的有機負荷(OLR)雖利于反應器的運行穩定，但增加了運行成本；而高OLR雖有助于有機物利用，但易導致系統酸化。故通過逐步提高OLR探索AnSBBR處理葡萄酒生產廢水所能承受的最大OLR尤為重要。目前，厭氧反應器在不同OLR下處理葡萄酒生產廢水的研究主要是OLR對消化性能的影響。然而，微生物對環境變化敏感，高OLR下導致反應器運行失敗的原因是破壞了體系中菌群結構的平衡。因此，有必要深入探究OLR變化對菌群結構的影響。
本研究采用AnSBBR處理模擬葡萄酒生產廢水，通過監測AnSBBR各OLR運行期間出水水質、甲烷產量和產甲烷活性等來評估AnSBBR處理葡萄酒生產廢水的性能，利用高通量測序對生物膜體系中群落結構的演替規律進行解析，確定AnSBBR處理葡萄酒生產廢水的最佳工況條件，旨在為推動AnSBBR的工程化應用提供依據。
1、材料與方法
1.1 接種污泥和進水
實驗所用生物膜填料和活性污泥取自西安市第四污水廠缺氧池，生物膜載體為K3填料(直徑25mm，比表面積500m2·m−3)，填料上掛膜量為2507.6mg·m−2，反應器中生物填充率為35%。使用4L活性污泥(5677.5mg·L−1)用于掛膜。進水用實際葡萄酒水稀釋配制，葡萄酒COD為(220450±2100)mg·L−1，總磷為(26.1±1.3)mg·L−1，總氮為(1479±37)mg·L−1，乙酸為(1409.6±13.8)mg·L−1，多糖為(2524.84±65.37)mg·L−1，蛋白質為(17899.47±203.31)mg·L−1，pH為3.99±0.2，投加碳酸氫鈉控制進水pH為7.3~7.5。
1.2 實驗裝置與運行
實驗所用AnSBBR有效容積為10L，φ270mm×360mm。采用蠕動泵間歇進水、推流泵攪拌，控制溫度為(35±1)℃，進出水和攪拌采用可編程控制器(PLC)控制，產生的沼氣流入濕式氣體流量計。
AnSBBR運行過程分為馴化啟動、強化和穩定3個階段，實驗期間進水COD、水力停留時間和有機負荷見表1。反應器采取低負荷啟動，起始COD為(1±0.1)g·L−1，通過縮短HRT提高有機負荷以完成對生物膜的馴化培養，處理后的廢水用于灌溉時，需滿足農田灌溉標準(GB5084-2021)中旱作物對COD排放的要求(COD<200mg·L−1)。強化階段，根據BEZERRA等的方法提升OLR。強化和穩定階段的運行周期為4h(包括進水5min、反應230min、出水5min)，進水體積為2L。
1.3 產甲烷速率測試
產甲烷速率測試能夠評估厭氧污泥的產甲烷潛力，分別在3種負荷(1.2、5.4、9.6g·(L·d)−1))下和接種污泥中進行。生物膜填料用PBS清洗3次后，加入250mL厭氧瓶中，再加入150mL營養液。氮吹5min以排出瓶中空氣，將厭氧瓶置于35℃水浴搖床，用排水集氣法測定甲烷，并配制2mol·L−1NaOH溶液，吸收H2S和CO2。最后利用Gompertz模型方程對產甲烷過程進行擬合分析，模型方程見式(1)。
式中：Pt為t時刻累積甲烷產量，mL·g−1(以TS計)；Pmax為最大甲烷產量，mL·g−1(以TS計)；Rmax為最大甲烷產率，mL·(g·h)−1(以TS計)；e=2.7183；λ為停滯時間，h。
1.4 分析項目及方法
1)理化指標分析。
采用哈希(DRB-200)消解儀消解COD；采用雷磁PHS-3C測定pH；采用濕式氣體流量計(LMF-1)計量沼氣；采用標準方法分析TS、VS；聯合滴定法測定總堿度(TA)、部分堿度(PA)，pH滴定終點分別3.8和5.75，碳酸氫鹽堿度(BA)為1.2PA；采用FID-氣相色譜儀(SP-3420A)測定VFAs；采用TCD-氣相色譜儀(SP-3420A)測定沼氣組分；參照LI等的熱提法提取胞外聚合物(EPS)并分別用苯酚硫酸法和福林酚法測定多糖(PS)和蛋白質(PN)；參照趙陽等的方法測定輔酶F420濃度；參照ZHAO等的方法測定INT-ETS；參照李韌等的方法測定生物膜量。
2)高通量測序。
取接種和反應器3種負荷(OLR為1.2、5.4和9.6g·(L·d)−1)的生物膜污泥，運用高通量測序技術對微生物群落結構進行分析。細菌和古菌用帶有barcode特異性引物515FmodF(5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806RmodR(5′-GGACTACNVGGGTWTCTAAT-3′)，針對全菌16SrRNA基因進行PCR擴增并利用Illumina公司的MiseqPE300平臺進行測序。使用IBMSPSS25.0軟件對數據進行顯著性分析，采用t檢驗，顯著性水平為P<0.05差異顯著。
2、結果與分析
2.1 AnSBBR運行效果分析
1)AnSBBR的運行特性。反應器連續運行的效果見圖1。反應器經37d馴化培養后，COD去除率由(52.2±17.4)%增至(75±12.2)%，出水COD降至(171±30)mg·L−1，滿足了農田灌溉標準(GB5084-2021)中旱作物對COD值的要求，表示AnSBBR啟動成功。強化運行階段(OLR為1.2~9.6g·(L·d)−1)，COD去除率(圖1(a))由81.6%增至97.7%，沼氣產量(圖1(b))由0.37L·(L·d)−1增至4.6L·(L·d)−1。pH在6.8~7.8內，TVFA為66~193mg·L−1，總堿度為780~1520mg·L−1；穩定運行階段(OLR為9.6~10.2g·(L·d)−1)，當OLR為10.2g·(L·d)−1時，出水COD最大，達到675mg·L−1，COD去除率降至94.9%，甲烷產率降至(332.4±28.7)mL·g−1，TVFA為532mg·L−1。隨后OLR降至9.6g·(L·d)−1，運行16d后，反應器各項運行參數重新恢復正常�？梢钥闯�，AnSBBR處理OLR為1.2~9.6g·(L·d)−1的葡萄酒生產廢水時，具備優異的處理性能。
圖1 連續運行下AnSBBR的性能表現
2)OLR對AnSBBR性能及穩定性的影響。有機物降解及甲烷產量是評價厭氧反應器消化效率的重要指標。OLR對反應器性能及穩定性的影響見圖2。OLR超過2.4g·(L·d)−1后，COD去除率維持在較高的水平(>96%)(圖2(a))。當OLR為1.2~5.4g·(L·d)−1時，甲烷產率隨OLR的提升而增加，OLR超過5.4g·(L·d)−1后甲烷產率隨OLR的提升而減少。當OLR為5.4g·(L·d)−1時，甲烷產率最大，達到(349.9±7.6)mL·g−1。對比穩定階段前后結果，可以看出，重新恢復后的反應器在COD去除率和甲烷產率方面表現更好。此外，與其他厭氧反應器對比，可以看出，AnSBBR在出水COD和甲烷產率方面更具優勢(表2)。
圖2 OLR對AnSBBR的性能及穩定性的影響
系統的緩沖能力是評估反應器運行穩定性的關鍵指標，其變化受消化過程中堿度和VFAs的共同影響。當OLR為10.2g·(L·d)−1時，pH降至7.0以下，但總堿度波動較小(圖1(c))，TVFA/TA<0.4(圖2(b))。這是因為碳酸氫鹽堿度被消耗轉化為揮發性脂肪酸堿度，但后者不能提供緩沖，從而出現pH降低但總堿度變化小的情況。這說明，TVFA/TA無法準確表示體系緩沖能力的變化情況，故再引入TVFA/BA。通常，在高OLR下，TVFA/BA<0.4時，系統處于穩定狀態。當OLR為1.2~9.6g·(L·d)−1)時，比值低于0.4，反應器緩沖能力良好(圖2(b))；當OLR為10.2g·(L·d)−1)時，比值增至(0.81±0.13)，反應器酸化風險激增。此時，乙酸增至(366.18±27.79)mg·L−1，丙酸為(51.63±10.35)mg·L−1，丁酸為(30.44±6.52)mg·L−1(圖2(d))，且體系中VFAs呈現出繼續增加的趨勢，表明反應器無法適應OLR為10.2g·(L·d)−1的運行條件。
2.2 生物膜體系特性
1)生物膜量。微生物利用有機物代謝并在填料表面聚集形成生物膜，并通過脫落更新來穩定生物量。OLR對生物量的影響見圖3。與接種污泥相比，當OLR為1.2g·(L·d)−1)時，生物量為1802.8mg·m−2，減少了28.0%(圖3(a))，這是部分原有微生物無法適應新環境導致的死亡脫落。在OLR從1.2g·(L·d)−1增至9.6g·(L·d)−1后，生物膜量由1802.8mg·m−2增至7108.8mg·m−2。這不僅得益于廢水中有機物易被微生物代謝利用，還因序批式工藝存在“吸收-儲存-利用”的特性，促進了微生物的增殖。
圖3 OLR對掛膜生物量，輔酶F420和INT-ETS活性的影響
輔酶F420是產甲烷菌特有的一種低電位電子載體。REYNOLDS等認為，輔酶F420由氫營養型產甲烷菌分泌，其濃度可反映產甲烷菌的數量或產甲烷活性。INT-ETS活性指微生物的電子傳遞速率，反映厭氧微生物的活性。輔酶F420濃度和INT-ETS活性隨負荷的提升而增加(圖3(b))，在OLR從1.2g·(L·d)−1增至5.4g·(L·d)−1期間，輔酶F420濃度和INT-ETS活性增加最為明顯，分別增加了115.2%和102.9%。
圖4反映了OLR對產甲烷速率的影響。使用Gompertz模型對結果進行擬合，結果見表3。針對特定的廢水，接種污泥對其降解的能力不足，甲烷產量和產甲烷速率分別為19.16mL·g−1和2.83mL·(g·h)−1。馴化后甲烷產量顯著增加，達到67.95mL·g−1，產甲烷速率為34.44mL·(g·h)−1。當OLR為9.6g·(L·d)−1時，產甲烷速率最大，為59.36mL·(g·h)−1，累計甲烷產量達到了172.68mL·g−1。可以看出，生物膜的產甲烷速率隨OLR的提升而提高，在OLR從1.2g·(L·d)−1增至5.4g·(L·d)−1期間，產甲烷速率提高較明顯，產甲烷速率和甲烷產量分別提高了68.0%和125.8%。
圖4 OLR對產甲烷速率的影響
總體來看，生物膜量、輔酶F420濃度、INT-ETS活性和產甲烷速率隨OLR的提升呈現不同程度的增加，但是在較高OLR下，增加速率明顯減緩。這說明，逐級提升OLR的運行策略可促進相關功能菌的富集，并加快微生物對基質的利用速率。但由于產甲烷菌屬對OLR的適應范圍存在差異，過高的OLR對部分產甲烷菌生長和代謝產生抑制，導致后續OLR提升過程對生物膜體系的促進效果削弱。
2)EPS特性。生物膜體系中胞外聚合物是實現微生物與載體、微生物與微生物之間黏附的關鍵，通過細胞分泌、脫落和外部吸附等途徑形成，主要由蛋白質和多糖組成。EPS空間結構包括溶解態EPS(Slime-EPS)、松散型EPS(LB-EPS)和緊密型EPS(TB-EPS)。馴化成功后的Slime-EPS和TB-EPS濃度相較于接種污泥明顯增加，Slime-PN和Slime-PS濃度分別提高了291.0%和103.0%，TB-PN和TB-PS濃度分別提高了58.5%和75.1%(圖5)。當原有微生物因無法適應新環境死亡脫落后被吸附在生物膜表面，從而使EPS最外層的Slime-EPS濃度明顯增加。TB-EPS是與細胞緊密結合的聚合物，當反應器成功啟動時，TB-EPS濃度的增加，有利于微生物聚集體的黏附聚集以及維持聚集體空間結構和功能的完整。隨后，微生物代謝增殖消耗EPS表面吸附的過量營養物質使得OLR為5.4g·(L·d)−1時EPS濃度降低。
圖5 OLR對EPS質量分數及其蛋白質和多糖濃度的影響
EPS存在于污泥表面，當環境發生改變時，其組成成分更易受到影響。各層EPS中PN/PS比值隨負荷的提升而增加，當OLR為9.6g·(L·d)−1時，Slime-PN/PS、LB-PN/PS和TB-PN/PS比值分別達到了3.54、2.56和3.28。PN具有疏水性，在逐級提升負荷期間，較高的PN/PS比值可以有效保證污泥的穩定性。重新穩定后，各層EPS中PN/PS的比值變小，分別為1.69、1.79和3.13。PN和PS攜帶相反的電荷基團，經更高負荷沖擊后，為避免過高VFA濃度可能導致的生物膜解體，EPS組分中PN/PS比值變小可以有效減少聚集體間的靜電排斥力，從而使生物膜更加密實，以應對高負荷環境對生物膜體系的影響。
2.3厭氧生物膜群落特性
1)門水平群落特性。門水平上菌群分布結果如圖6所示。經馴化后，優勢菌(相對豐度>7%)從Desulfobacterota(21.1%)、Proteobacteria(17.1%)、Chloroflexi(13.7%)、Bacteroidota(11.8%)和Firmicutes(10.3%)演替為Bacteroidota(22.4%)、Chloroflexi(19.5%)、Halobacterota(11.8%)、Euryarchaeota(11.7%)和Proteobacteria(7.4%)，這表明進水基質組分將顯著影響微生物群落結構。在OLR從1.2g·(L·d)−1增至9.6g·(L·d)−1期間，優勢菌Proteobacteria(P>0.05)、Desulfobacterota(P<0.05)和Spirochaetota(P<0.05)豐度隨OLR提升而增加。Halobacterota(P<0.05)和Chloroflexi(P>0.05)豐度隨OLR提升而減少。Proteobacteria、Chloroflexi、Spirochaetota和Bacteroidota是中溫厭氧體系中常見的水解細菌，可將蛋白質和碳水化合物降解為VFAs或乙醇等物質。Firmicutes和Euryarchaeota豐度呈現先增后減的趨勢，而Bacteroidota豐度則是先減后增。這說明，在低OLR下，Firmicutes更易表現出高聚集性；在高OLR下，Bacteroidota生物活性更高。在釀造工序中會添加SO2抑制細菌，SO2氧化后以硫酸鹽的形式存在于廢水中，Desulfobacterota可將硫酸鹽轉化為硫化氫。
圖6 生物膜群落門水平上的相對豐度(豐度>2%)
Halobacterota和Euryarchaeota均為產甲烷古菌門。當OLR為1.2、5.4和9.6g·(L·d)−1時，菌群中古菌門整體相對豐度分別約為22.5%、26.7%和16.5%。這表明，在OLR從1.2g·(L·d)−1增至5.4g·(L·d)−1期間，產甲烷古菌得到了富集，增強了AnSBBR的消化性能和穩定性。在負荷進一步提升后，豐度明顯下降，說明高負荷環境對部分產甲烷古菌存在抑制效果。
2)屬水平群落特性。接種污泥經馴化后，Methanobacterium(11.7%)、Methanosarcina(10.3%)、Anaerolineaceae_UCG-001(5.9%)、Longilinea(5.5%)和Leptolinea(4.3%)成為主要的菌屬(圖7)。Methanobacterium是利用H2/CO2產生CH4的嗜氫產甲烷菌，Methanosarcina是可同時利用乙酸、H2/CO2和甲基三種底物的產甲烷菌。因二者均屬r策略菌，具備世代時間短、比生長速率高的特性，在馴化后豐度明顯增加。Anaerolineaceae_UCG-001、Longilinea和Leptolinea可轉化多糖等碳水化合物為乙酸，葡萄酒生產廢水中豐富的有機物促進了菌屬的增殖。
圖7 生物膜群落屬水平上的相對豐度(豐度>1%)
在OLR從1.2g·(L·d)−1增至9.6g·(L·d)−1期間，主要存在4種古菌屬和8種細菌屬(相對豐度>3%)。Methanosarcina、Anaerolineaceae_UCG-001和Longilinea豐度隨OLR提升而減少(P>0.05)；Methanobrevibacter與Paludibacter(P>0.05)，Desulfovibrio與Treponema(P<0.05)豐度隨OLR提升而增加；Methanobacterium、Acinetobacter和Brevinema豐度呈現先增后減的趨勢，Methanosaeta豐度變化與之相反。
在OLR從1.2g·(L·d)−1增至5.4g·(L·d)−1后，Methanobacterium豐度由11.7%增至17.1%，Methanosaeta豐度由1.4%增至5.3%，Desulfovibrio豐度由0.8%增至5.6%，Brevinema豐度由0.01%增至4.6%，Methanosarcina豐度由10.3%降至3.7%，Anaerolineaceae_UCG-001豐度由5.9%降至1.7%，Longilinea豐度由5.5%降至1.3%。研究顯示，專性嗜乙酸產甲烷菌Methanosaeta在較低的OLR下對乙酸的利用率更高，從而抑制了Methanosarcina的生長。Desulfovibrio是典型的乙醇氧化菌，能夠代謝包括乙醇在內的多種碳水化合物，隨進水有機物濃度的增加而逐漸富集。
在OLR從5.4g·(L·d)−1增至9.6g·(L·d)−1后，Desulfovibrio豐度由5.6%增至12.4%，Paludibacter豐度由1.3%增至5.8%，Methanobrevibacter豐度由0.02%增至3.3%，Treponema豐度從1.3%增至4.3%，Methanobacterium豐度由17.1%降至8.3%，Methanosaeta豐度由5.3%降至1.8%。Desulfovibrio進一步富集后，與Methanosaeta和Methanosarcina競爭基質中的乙酸，又因Methanosarcina可利用多種基質代謝，故受到的影響明顯小于Methanosaeta。Paludibacter為產酸菌，可利用多種單糖和二糖產生乙酸、丙酸，Treponema參與同型產乙酸過程。Methanobrevibacter可通過產生氧化型NAD+載體來提高產甲烷活性，并且在高OLR下生物活性更高。
當OLR為1.2、5.4和9.6g·(L·d)−1時，菌群中整體古菌屬相對豐度分別約為23.4%、26.3%和16.2%；當OLR為5.4g·(L·d)−1時，產甲烷古菌整體豐度最大并且存在Methanosphaerula(0.2%)等其他產甲烷菌。產甲烷過程作為厭氧消化的限速步驟，產甲烷菌的豐度越大、種類越多，越有利于提高生物膜體系的消化性能和應對潛在環境變化的能力。
3、結論
1)在滿足出水COD低于200mg·L−1的前提下，AnSBBR可有效處理OLR為1.2~9.6g·(L·d)−1的葡萄酒生產廢水。OLR為5.4g·(L·d)−1時，運行性能最佳，COD去除率為(97.2±0.5)%，甲烷產量和甲烷產率分別為20.2L·d−1和(349.9±7.6)mL·g−1。
2)與OLR為1.2g·(L·d)−1相比，OLR為9.6g·(L·d)−1時，產甲烷速率提高69.3%，生物膜量增加294.3%，輔酶F420濃度增加190.8%以及INT-ETS活性提高88.4%。這說明，逐級提升OLR的運行策略可促進厭氧生物膜體系的生長。
3)高通量測序顯示，群落中主要細菌為Desulfovibrio、Brevinema、Treponema、Longilinea、Paludibacter和Leptolinea，主要古菌為Methanobacterium、Methanobrevibacter，Methanosaeta和Methanosarcina，其相對豐度隨負荷的提升發生變化。當OLR為5.4g·(L·d)−1時，產甲烷菌整體豐度最大且多樣性更高；當OLR為9.6g·(L·d)−1時，培養出特定的菌屬(Methanobrevibacter)來適應環境。（來源：寧夏大學生態環境學院，中國葡萄酒產業技術研究院，西安建筑科技大學環境與市政工程學院，寧夏大學地理科學與規劃學院）
