全程自養脫氮工藝(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite, CANON)是近年發展起來的新型脫氮工藝.其原理是在單一反應器內, 利用好氧氨氧化細菌(AOB)和厭氧氨氧化細菌(AnAOB)的協同作用, 將水中的NH4+-N直接轉化為N2, 該工藝不消耗有機碳源, 耗氧量低且污泥產量低, 被認為是最具發展前景的脫氮工藝. CANON工藝的啟動方法大多是顆粒污泥技術或者是以生物膜為載體, 其原理是在顆粒污泥表面或者膜外形成好氧區以實現短程硝化, 在顆粒污泥內部或者膜內形成厭氧區以為厭氧氨氧化菌提供適宜的生存環境, 以此實現聯合脫氮.
目前CANON工藝主要應用在處理如污泥消化液等高氨氮廢水, 應用于城市生活污水中還存在短程不穩定、污泥流失生物量減少、啟動時間長難以穩定維持等問題.本研究在CSTR反應器以纖維載體為填料, 同時接種亞硝化污泥和厭氧氨氧化絮狀污泥啟動CANON, 并且為減少有機碳源對CANON系統的影響, 在CANON系統前端設置ABR除碳系統, 構建一體化ABR除碳-CANON耦合工藝, 用于處理城市污水, 同時采用MiSeq高通量測序技術對CANON系統啟動前后的微生物進行檢測, 從分子生物學角度分析接種污泥前后的菌群結構變化, 以期為CANON工藝處理城市生活污水提供宏觀和微觀依據.
1 材料與方法1.1 實驗裝置
本實驗裝置由有機玻璃制成, 總有效體積11 L, 反應器長52 cm, 寬8 cm, 有效高度30 cm, 由ABR除碳系統和CSTR全程自養脫氮系統(CANON)組成(如圖 1). ABR系統每隔室升流區和降流區隔間寬度比為4 :1, 折流板導向角45°, 有效容積為6.5 L. CANON系統分為曝氣池和沉淀池兩部分組成, 有效容積分別為5.5 L和0.96 L, 反應器長17 cm, 寬8 cm, 有效高度40 cm, 采用蠕動泵連續進水, 溢流出水, 反應器內掛有帶狀的辮帶式填料.曝氣區底部裝有曝氣裝置, 以提供溶解氧, 并使泥水充分混合.整個反應器始終置于恒溫水浴箱中, 溫度控制在(30±1)℃.
圖 1
1.2 接種污泥和實驗進水
ABR除碳污泥取自蘇州某生活污水處理廠缺氧池污泥, ABR反應器各隔室接種污泥量約占各隔室2/3.亞硝化污泥和厭氧氨氧化污泥均來源于實驗室的亞硝化反應器和厭氧氨氧化反應器, 接種污泥量均為500 mL.
采用人工配水模擬城市污水, 以(NH4)2SO4為氮源(50 mg ·L-1左右), 以乙酸鈉為碳源, 加碳酸氫鈉以調節pH至7.5左右.另外還包括生物所需的其他營養元素氯化鈣(10 mg ·L-1)、硫酸鎂(10 mg ·L-1)、磷酸氫二鉀(4 mg ·L-1)及微量元素.微量元素分為微量元素Ⅰ和微量元素Ⅱ, 微量元素按照1mL ·L-1添加.微量元素Ⅰ組分(g ·L-1): EDTA 5, FeSO4 5;微量元素Ⅱ組分(g ·L-1): EDTA 15, ZnSO4 ·7H2O 0.43, CoCl2 ·6H2O 0.24, MnCl2 ·4H2O 0.99, CuSO4 ·5H2O 0.25, NaMoO4 ·2H2O 0.22, NiCl2 ·6H2O 0.19, NaSeO4 ·10H2O 0.21, H3BO4 0.014.
1.3 分析方法
本實驗過程中每隔1 d取水樣測定, 測定項目NH4+-N:納氏試劑分光光度法; NO2--N: N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法; NO3--N:紫外分光光度法; MLSS、MLVSS:標準重量法; SVI: 30 min沉降法; pH: pHS-9V數顯酸度計; 溶解氧: YSI550A溶氧儀.
1.4 微生物高通量測序分析
分別將實驗前后的CANON系統中污泥采集送樣, 采用FastPrep DNA提取試劑盒(QBIOGENE, USA)提取DNA, 完成基因組DNA抽提后, 利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA.用16S rRNA基因引物338F(ACTCCTACGGGAGG CAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對細菌16S rRNA基因進行PCR擴增, PCR儀采用ABI GeneAmp® 9700型, 采用TransGen AP221-02; TransStart Fastpfu DNA Polymerase, 20 μL反應體系.反應程序為95℃預變性3 min, 95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 27個循環后, 72℃延伸10 min, 每個樣品重復3次.
使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)切膠回收PCR產物, 委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成對PCR擴增產物的高通量測序, 微生物多樣性分析于上海美吉醫藥生物科技有限公司所提供的Ⅰ-Sanger生信分析云平臺上完成.
2 結果與討論2.1 CANON脫氮性能
混合亞硝化污泥和厭氧氨氧化污泥后, 在CANON啟動過程中, 控制HRT為6 h、氨氮負荷為0.195 kg ·(m3 ·d)-1, 為避免DO對ANAMMOX菌產生影響, 且保證AOB能夠利用DO進行短程硝化, 控制DO為0.5 mg ·L-1.在啟動反應器的前5 d, 在進水NH4+-N為43~47 mg ·L-1時, 出水NH4+-N為21~25 mg ·L-1, NO3--N維持在6 mg ·L-1左右, 然而出水亞硝態氮卻高達31~41 mg ·L-1 (如圖 2).這是因為微生物所在環境的改變, 使得接種的厭氧氨氧化污泥中微生物生長繁殖受到抑制因而發生細胞自溶, 從而釋放出大量的NH4+-N, NH4+-N又被氨氧化菌(AOB)氧化為NO2--N, 故而導致出水NO2--N較高.在隨后5~10 d里, 出水NH4+-N濃度持續升高至38 mg ·L-1, 出水NO2--N下降至1 mg ·L-1以下, 出水NO3--N亦下降至2~4 mg ·L-1, 表明此時曝氣量提供的DO已不能滿足反應器的需求, 過低的曝氣量致使大量的NH4+-N未能被AOB利用, 厭氧氨氧化菌(ANAMMOX)只能利用AOB產生的少量NO2--N與進水NH4+-N產生氮氣, 總氮去除率為14%~17%, CANON脫氮效果低下.故在CANON啟動的第11 d調高曝氣量, 此時DO達到1.2 mg ·L-1, 出水NH4+-N迅速降低, NO2--N略有升高至5~7 mg ·L-1, NO3--N濃度基本不變, 維持在2~6 mg ·L-1, 反應器性能得以迅速提升.在接下來的40 d中, 根據出水氨氮情況的變化, 調節曝氣量, DO逐漸升高至2 mg ·L-1, 出水NH4+-N穩定在2~7 mg ·L-1、NO2--N為0~3 mg ·L-1, NO3--N為2~4 mg ·L-1, TN去除率為81%~87%, 反應器性能穩定.具體聯系污水寶或參見http://m.xhxdt.com更多相關技術文檔。
圖 2
在整個CANON系統啟動過程中, 出水NO3--N濃度一直較低(6 mg ·L-1以下), 說明亞硝酸鹽氧化菌的活性一直處于被抑制的狀態, 這是因為在整個啟動過程中DO一直處于2 mg ·L-1以下, 周律等在生物膜系統中考察不同濃度的溶解氧對亞硝酸鹽積累的影響時發現, 當DO濃度為1.5 mg ·L-1時, 可以實現最大程度的亞硝酸鹽積累; 且由于CANON反應器是一體式反應器, 系統中既有AOB和NOB又有ANAMMOX, 這樣NOB除了要與AOB爭奪氧氣外, 還要與ANAMMOX爭奪亞硝酸鹽, 受到雙重競爭; 除此之外反應器溫度控制在(30±1)℃, 在如此高的溫度下, AOB比NOB生長更快, 同時該溫度也接近AnAOB的最佳生長溫度, 所以在整個啟動過程中, 出水NO3--N濃度始終處于6 mg ·L-1以下.
2.2 ABR除碳-CANON工藝的脫氮除碳性能
由于厭氧氨氧化反應功能菌世代時間長, 生長條件苛刻, 在有機物濃度過高的情況下, 反應過程和脫氮效果極易受到影響, 為保證ABR段出水中有機物濃度不對后續CANON系統中ANAMMOX菌產生影響, 本實驗在ABR系統和CANON系統耦合之前, 對ABR系統做單獨運行.如圖 3, 進水COD在300~400 mg ·L-1之間, HRT為6 h, 經過45 d運行, 出水COD由250 mg ·L-1左右逐漸下降至170 mg ·L-1左右.
圖 3
汪瑤琪等所做研究認為有機物濃度控制在100~200 mg ·L-1之間, 可降低有機物對ANAMMOX菌活性的抑制, 傅金祥等的研究結果表明, 當COD≤120 mg ·L-1時, 有機物對厭氧氨氧化不僅沒有抑制作用, 反而有促進作用, 李冬等在研究有機碳源對CANON工藝的影響時發現, 適量有機物(不超過150 mg ·L-1)的存在會通過增強亞硝化菌(AOB)和厭氧氨氧化菌(AnAOB)的活性和促進反硝化作用來提高氨氮和總氮的去除率, 而本實驗在CANON系統中存在好氧異養菌, 好氧異養菌又能消耗一部份有機物, 所以在ABR單獨運行45 d后, 對ABR系統和CANON系統進行耦合.
本實驗在啟動后期, 雖然有機物進入CANON系統, 但是總氮去除率并沒有降低, 穩定在74%~87%(圖 4), 這是因為厭氧氨氧化反應系統在有有機物的情況下, 系統內的異養反硝化菌與自養厭氧氨氧化菌可以協同作用使系統內同時發生異養反硝化反應與ANAMMOX反應.其中, ANAMMOX反應在消耗氨氮和亞硝酸鹽氮的同時產生少量的硝酸鹽氮, 而異養反硝化菌則可以通過反硝化將ANAMMOX反應過程中生成的硝酸鹽氮降解, 從而提高系統的TN去除率, 另一方面, 適量有機物(不超過150 mg ·L-1)的存在使得異養菌適度生長, 這些異養菌產生的胞外聚合物使填料表面黏度變大, 因而有利于污泥的持留, 有利于一體式ABR除碳-CANON系統的穩定.
圖 4
2.3 微生物菌群結構變化
利用MiSeq高通量測序平臺對CANON系統實驗前(剛接種亞硝化污泥和厭氧氨氧化污泥于CANON系統中)和實驗后(實驗進行100 d)污泥中微生物多樣性進行分析, 本研究中2個樣本的覆蓋率均大于99.99%, 可確保本次測序結果能夠代表樣本中微生物群落組成.如表 1所示, Chao1和ACE指數有所增加, 表明實驗后的CANON污泥擁有更高的微生物物種豐度. Shannon和Simpson指數變化較小, 實驗前后CANON微生物多樣性略有增加.
表 1 CANON系統實驗前后微生物多樣性變化
如圖 5, 實驗前后Proteobacteria(變形菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)和Chloroflxi(綠彎菌門)均為豐度較高的菌門, 而實驗后Proteobacteria得到了顯著提升, 由實驗前的22.56%上升到61.02%, Bacteroidetes和Chloroflxi均有不同程度地減少.有研究表明, Proteobacteria在大多數厭氧氨氧化系統中占據主導地位, 且β-Proteobacteria綱幾乎涵蓋了所有類型的AOB, 這也從微生物角度解釋了本實驗脫氮效能提高的原因.
圖 5
活性恢復前, 為進一步闡明厭氧氨氧化反應器啟動前后微生物群落結構的變化情況, 對綱水平下的菌群結構作進一步的分析.如圖 6所示, 實驗后CANON系統中γ-Protebacteria綱數量上占據絕對優勢, 鄭平等和Heylen等指出γ-Protebacteria對于系統的脫氮和反硝化有很大的貢獻, 這與本實驗結論一致. Sphingobacteria(鞘脂桿菌綱)與好氧反硝化關系密切, 實驗前Sphingobacteria綱所占比例為34%, 實驗后Sphingobacteria綱所占比例下降為6.8%, 這是因為本實驗所接種的亞硝化污泥中含有大量的好氧反硝化菌, 而經過100 d實驗后, 好氧反硝化菌逐漸被淘汰, 這也從側面證明了本實驗脫氮的主要方式為亞硝化與厭氧氨氧化的聯合作用.
圖 6
3 結論
(1) 通過在CSTR反應器中同時接種亞硝化和厭氧氨氧化污泥, 控制DO為0.5~2 mg ·L-1、HRT為6 h、氨氮負荷為0.195 kg ·(m3 ·d)-1、pH值為8左右等措施, 在55 d內成功啟動CANON系統, TN去除率為81%~87%.
(2) ABR除碳系統出水有機物濃度(120 mg ·L-1)不會對后續CANON系統產生不利影響, 一體式ABR除碳-CANON工藝TN去除率在74%~87%, 出水COD平均濃度為40 mg ·L-1, 一體化ABR除碳-CANON工藝可以對城市污水穩定高效脫氮.
(3) CANON系統啟動前后Proteobacteria門得到了顯著提升, Sphingobacteria綱所占比例下降為6.8%, CANON系統中亞硝化菌和厭氧氨氧化菌不斷淘汰劣勢菌群成為反應器內優勢菌群.(來源：環境科學 作者：李田)
