隨著工業及社會經濟的迅速發展，水體富營養化污染日益嚴重，水中氮素污染的去除已成為當今水污染防治領域的熱點問題.近年來，污水處理排放標準日益嚴格，污水中總氮的去除難度也將逐漸提高.理論認為，生物脫氮由硝化反應和反硝化反應協同完成，反硝化作用通過反硝化酶系在缺氧/厭氧條件下的活性表達而實現總氮的去除.傳統活性污泥法、好氧顆粒污泥[3]和人工濕地等技術都是基于硝化反硝化的脫氮技術.然而近年來涌現的厭氧氨氧化和好氧反硝化等技術則有別于傳統生物脫氮理論，其中隨著Robertson等對好氧反硝化菌和好氧反硝化酶系的研究逐步深入，越來越多的研究發現反硝化過程不僅可以在缺/厭氧條件下發生，在好氧條件也能進行并具有較好的脫氮效果.
完全混合式曝氣系統具有占地面積較小，投資和能耗較低，抗沖擊負荷能力較強的優點，曝氣系統內各點底物濃度，污泥濃度和需氧速率相同，為系統內同步硝化反硝化發生提供了基礎.到目前為止對同步硝化反硝化作用機制存在不同認知：微環境理論認為物質傳遞(有機物、電子受體)、菌膠團結構及各類微生物分布和活動等致使菌膠團內部形成多種多樣的微環境類型，為同步硝化反硝化的存在創造可能;而從生物學角度闡釋同步硝化反硝化機制則始于對好氧反硝化菌株Thiosphaera pantotropha的研究，好氧反硝化菌細胞內存在不受DO抑制的反硝化酶系統，其好氧反硝化能力與胞內特殊硝酸鹽還原酶--周質硝酸鹽還原酶表達密切相關，Huang等對具有好氧反硝化功能的菌株DNA進行周質硝酸鹽還原酶亞基基因napA擴增，得到了明顯的DNA特異條帶，證明了好氧反硝化菌可以表達周質硝酸鹽還原酶.但目前基于完全混合式曝氣系統同步硝化反硝化的形成條件和污泥微生物菌種結構解析的研究還相對較少，從而限制了完全混合式曝氣系統的發展與應用.
因此，本文以無錫市某污水處理廠100 t·d-1完全混合式曝氣系統的運行為出發點，通過進出水水質分析，研究系統對污染物的去除效能;結合反硝化速率靜態試驗，闡明系統污泥在好氧條件下的反硝化脫氮能力;通過周質硝酸鹽還原酶PCR擴增和高通量測序技術，對系統污泥微生物菌群結構和多樣性進行解析，并確定系統內優勢菌群，以期為完全混合式曝氣系統的反硝化脫氮應用提供理論依據和技術支撐.
1 材料與方法1.1 完全混合式曝氣系統運行
完全混合式曝氣系統(中試規模)在無錫某城鎮污水處理廠運行，系統為鋼板池體，長約為10 m、寬為1.5 m、高為3.5 m，設計處理能力為100 t·d-1，工藝流程如圖 1所示.原水通過進水泵進入生化罐，然后依次流經生化池1、生化池2和生化池3，生化罐及各生化池底部均布置穿孔管曝氣，最后進入過濾沉淀池進行泥水分離(利用沉淀池中部微孔過濾器進行泥水分離，微孔濾料孔徑為0.45 μm，對反應器內污泥進行截留)，處理后出水外排.系統包括兩套回流系統，分別維持生化罐和生化池內的污泥濃度.系統自2011年啟動運行，效果穩定，2015年春節前停止運行，春節后再次啟動，運行參數如下：進水流量為3 m3·h-1，HRT為10~12 h，SRT大于30 d，反應器內污泥濃度為7~10 g·L-1，回流比Q1為150~200%，Q2為200%，DO設定為1~3 mg·L-1，濾料反沖洗頻率為8 h.污泥來源于污水處理廠好氧池.
1.2 進水水質
完全混合式曝氣系統進水取自污水處理廠提升泵房之前深度約4.5 m左右的污水，水質如表 1所示.
表 1 污水處理廠進水水質/mg·L-1
1.3 試驗方法1.3.1 污染物指標測定
COD、NH4+-N、TN、NO2--N和NO3--N通過標準方法進行測定;DO、pH采用Multi3410型溶氧儀測定.
1.3.2 反硝化模擬試驗
為了驗證完全混合式曝氣系統中污泥在不同DO梯度下的反硝化活性差異，對系統污泥進行反硝化模擬試驗.共設置3組試驗，控制溫度為20℃，初始硝態氮濃度45 mg·L-1，以無水乙酸鈉為碳源，按C/N=7投加，采用微曝氣供氧，反應過程DO濃度分別控制為0.1~0.2、1.0~2.0和2.0~3.0 mg·L-1，污泥濃度均控制為4 000 mg·L-1左右(MLVSS/MLSS=0.52).分別在反應第0、30、60、90、120、150、180、210和240 min取樣，將取出的混合液過濾后測定其硝酸鹽濃度.最后根據不同時刻硝酸鹽濃度變化與測定混合液中MLVSS的值，計算反硝化速率.
1.3.3 同步硝化反硝化能力測定
完全混合式曝氣系統的同步硝化反硝化能力(simultaneous nitrification and denitrification，SND)可以通過計算同步硝化反硝化率[式(1)]和同步硝化反硝化速率[式(2)]得到：
式中，Efficiency(SND)為同步硝化反硝化率(%);R(SND)為同步硝化反硝化速率mg·(L·h)-1;NH4(oxidized)+為NH4+-N的消耗量(mg·L-1);NOx(produced)-為NO3--N和NO2--N的生成量(mg·L-1);t為運行時間(h).
1.3.4 總DNA提取及測序
取適量系統污泥樣品放入2 mL離心管內，充分振蕩30 s，在10 000 r·min-1條件下離心1 min，棄去上清液.樣品經預處理后采用MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit試劑盒提取污泥樣品中微生物總宏基因組，然后用NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測DNA的濃度和純度，最后置于-20℃下保存備用.測序工作由上海晶能生物技術有限公司完成，測序儀器(平臺)為Illumina MiSeq，采用Trimmomatic軟件對序列進行去雜，采用Qiime軟件進行群落豐度計算.
1.3.5 周質硝酸鹽還原酶亞基基因(napA)的PCR擴增
由于污泥長期在完全混合式曝氣系統中馴化，因此對系統污泥中是否存在好氧反硝化菌進行鑒定.采用周質硝酸鹽還原酶亞基基因保守區的一部分序列為引物，引物NAP1(5′-TCTGGACCATGGGCTTCAACCA-3′)和NAP2(5′-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3′)，擴增產物長度為877bp. PCR反應體系(50 μL)：10×buffer 4 μL，dNTP2 μL，引物NAP1和引物NAP2各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶(10 000 U·mL-1)0.8 μL，重蒸水38.2 μL. PCR程序如下：94℃變性5 min;然后進行30個循環：94℃，30 s;59℃，30 s;72℃，60 s;最后72℃延伸7 min. PCR產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證.
2 結果與討論2.1 COD去除效果
完全混合式曝氣系統對沖擊負荷表現出較好的抵抗能力，系統穩定運行后，盡管進水COD濃度波動較大，但出水COD較穩定，基本維持在7.8~35.3 mg·L-1，平均值為17.1 mg·L-1，優于GB 18918-2002的一級A排放標準，COD去除率為82.4%~98.3%，平均去除率為93.2%.結果表明維持系統較高的污泥濃度(7~10 g·L-1)可以保證生物降解的穩定性，使整個工藝對COD的去除保持在較高水平.
圖 2顯示了系統沿程COD變化趨勢.原水COD濃度約346 mg·L-1，進入系統后迅速下降，經過回流稀釋作用及曝氣條件下異養菌對碳源的消耗，生化罐中混合液COD濃度已降至86 mg·L-1，系統出水COD濃度約為20 mg·L-1.由此可見，完全混合式曝氣系統具有較強的COD去除能力，其原因在于：① 系統采用完全混合曝氣的模式，強化了異養菌對有機物的降解與消耗;② 系統具有較大的回流，延長了污水實際水力停留時間，從而強化了系統對有機污染物的去除能力.完全混合式曝氣系統可以為包括好氧反硝化菌在內的異養微生物提供適宜的生長環境，而大部分好氧反硝化菌同時具有異氧硝化及代謝降解有機物的能力，可以在曝氣條件下表現出對有機底物較高的去除能力.
圖 2 進出水COD濃度及沿程變化特征
2.2 氮去除效果
完全混合式曝氣系統進出水NH4+-N、TN變化曲線如圖 3所示.系統進水NH4+-N為1.33~57.1 mg·L-1，均值為30.3 mg·L-1，出水NH4+-N為0.2~5.6 mg·L-1，均值為0.89 mg·L-1，平均去除率達96.9%，出水NH4+-N超標率低于2%.系統進水TN波動較大，在7.7~58.3 mg·L-1之間，均值為33.6 mg·L-1，出水TN在1.9~26.9 mg·L-1范圍波動，平均去除率為75.2%，均值為7.8 mg·L-1，出水氨氮和TN均優于GB 18918-2002的一級A排放標準，表明系統具有較強的脫氮能力.當系統運行至第70 d左右時，出水TN濃度高于20 mg·L-1，這是由于濾池內濾料出現堵塞現象，增加系統反沖洗頻率后使反沖洗過程中部分污泥顆粒隨出水流出，導致系統TN升高.但在恢復反沖洗頻率后，出水水質得以改善.
圖 3 進出水NH4+-N和TN濃度的變化
為了考察完全混合式曝氣系統各單元對氮轉化的作用和貢獻，對其各單元出水中氮組分及濃度進行測定，結果如圖 4所示.根據式(1)和(2)計算得生化罐的同步硝化反硝化率為99.6%，同步硝化反硝化速率為32.9 mg·(L·h)-1，生化罐中具有良好的同步硝化反硝化能力，氨氮進入生化池1后持續降低，最終出水氨氮低于1 mg·L-1.生化池1的同步硝化反硝化率為94%，同步硝化反硝化速率為1.1 mg·(L·h)-1.由圖 4中總氮，硝態氮及亞硝態氮的變化可知，系統同時具備較強的反硝化脫氮能力，而且不存在亞硝酸鹽的積累現象.系統僅在單一曝氣條件下就能實現同步硝化反硝化，有效節省了占地面積并在系統堿度維持方面更具有經濟性.
圖 4 不同形態氮濃度的沿程變化
為進一步研究系統各反應單元的實際運行狀態，對每個反應單元的DO進行24 h連續監測，結果如表 2所示.生化罐和生化池1內溶解氧較低，其DO均低于0.5 mg·L-1，生化池2和生化池3的DO濃度較高，一般維持在1~4 mg·L-1.其原因在于進水有機物濃度較高，異養菌在曝氣條件下快速降解有機物并消耗大量溶解氧，導致在系統前段(生化罐和生化池1)溶解氧明顯低于設定值.隨著有機物的消耗，系統后段(生化池2和生化池3)的DO濃度逐漸上升.通過核算發現生化罐和生化池1中硝酸鹽濃度分別降低1.82 mg·L-1和1.67 mg·L-1，而在生化池2和生化池3中硝酸鹽濃度略有上升，但總氮呈降低趨勢，系統中可能存在好氧反硝化菌群.研究表明不同菌屬的好氧反硝化菌對DO的耐受能力存在顯著差異，大部分好氧反硝化菌在DO濃度低于3 mg·L-1時仍具有較高的反硝化活性.根據系統氮平衡分析，生化罐和生化池1中的同步硝化反硝化現象明顯強于生化池2和生化池3，其原因可能基于以下兩方面：第一，系統前段C/N明顯高于后段，較高的C/N能保證充足的碳源，進而有利于反硝化反應順利進行，Ahmad也在研究中發現，好氧反硝化菌的反硝化活性同樣隨著C/N的升高而增大;第二，較低的DO濃度有利于活性污泥絮體內部形成缺氧微環境，從而使缺氧反硝化與好氧反硝化相協同，進一步強化同步硝化反硝化效果.
表 2 系統DO分布/mg·L-1
2.3 反硝化特性
反硝化模擬試驗的硝態氮濃度隨時間變化曲線如圖 5所示，在DO濃度為0.1~0.2 mg·L-1時，完全混合式曝氣系統中污泥在最初的2 h內硝酸鹽還原效果明顯，其脫氮速率(以NO3--N/MLVSS計，下同)為4.09 mg·(g·h)-1.當DO濃度在1.0~2.0 mg·L-1和2.0~3.0 mg·L-1時，污泥脫氮速率分別為0.73和0.67 mg·(g·h)-1，系統污泥在低DO濃度條件下的脫氮能力約為高DO濃度條件下的5.8倍.這是因為系統污泥中的反硝化菌群適應低DO條件，從而表現出更高的活性;同時，DO會優先于NO3--N被異養微生物利用，且相對較高DO濃度會有利于異養菌消耗有機物，從而使反硝化菌群在高DO條件下的反硝化能力受到抑制[22].當DO較高時，系統污泥仍具有較好的反硝化效果，表明系統中可能存在好氧反硝化菌群.
圖 5 不同DO條件下污泥反硝化效果
取污水處理廠污泥與系統污泥反硝化能力進行對比發現，當控制DO濃度為0.1~0.2 mg·L-1時，兩座污水處理廠缺氧池污泥反硝化能力明顯受到抑制，其脫氮速率僅為0.58和1.43 mg·(g·h)-1，反硝化能力明顯低于完全混合式曝氣系統污泥.
完全混合式曝氣系統一般運行約30 d即可實現對COD、氨氮和總氮的穩定高效去除，隨著進水沖擊負荷的變化，污染物去除效果穩定.系統運行過程中極少出現污泥上浮與污泥膨脹等不利現象，適用性較高.
2.4 微生物特性
由圖 6可知，完全混合式曝氣系統在有氧條件下的反硝化能力明顯優于傳統活性污泥，因此對活性污泥進行周質硝酸鹽還原酶亞基基因(napA)的PCR擴增.
圖 6 系統污泥與傳統活性污泥在低DO條件下的反硝化效果
試驗結果如圖 7所示，編號1、2和3為系統春季運行時污泥樣品;4和5為污水處理廠A缺氧池污泥樣品(系統所在污水處理廠);6和7為污水處理廠B缺氧池污泥樣品;8和9為系統秋季運行時污泥樣品.系統污泥得到明顯清晰的877 bp的DNA特異條帶，表明系統污泥存在周質硝酸鹽還原酶亞基基因napA，可以表達周質硝酸鹽還原酶，污泥中含有典型的好氧反硝化細菌，其在好氧條件下經由周質硝酸鹽還原酶的催化還原硝酸鹽，產生氮氣實現好氧反硝化，提高系統的總氮去除能力.污水處理廠A中活性污泥顯示存在特異性條帶，表明污水處理廠A中存在少量好氧反硝化菌，但是其強度較低，未在反硝化微生物中占優勢，無法顯著增強污水處理廠A的總氮去除效果，而污水處理廠B幾乎不存在好氧反硝化菌.
圖 7 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖像
為準確反映完全混合式曝氣系統內的微生物群落結構，對系統穩定運行的不同時期(春季和秋季)的微生物群落結構進行解析.通過高通量測序發現，系統污泥中微生物共有42個綱，污泥微生物比例分布如圖 8所示(選取比例超過1%的綱繪入圖中).不同時期系統污泥微生物菌群結構基本一致，以變形菌綱為主，其中β變形菌綱、γ變形菌綱、δ變形菌綱和α變形菌綱比例分別占變形菌綱54.45%、10.60%、7.80%和7.85%;鞘脂桿菌綱占6.02%，厭氧繩菌綱占2.71%，放線菌綱占1.66%，酸桿菌綱占1.03%.其中β變形菌綱與污水處理過程密切相關，是污水處理廠脫氮的重要菌群，可以在低溶解氧條件下利用有機物生長繁殖.測序結果表明(表 3)，系統污泥微生物中動膠菌屬(Zoogloea)，陶厄氏菌屬(Thauera)和Dechloromonas菌屬始終處于優勢地位，其中Zoogloea屬與菌膠團的形成有密切關系，可能會促進系統實現同步硝化反硝化作用;Thauera屬是β變形菌中的一類革蘭氏陰性細菌，大部分為桿狀且以反硝化菌居多，如T. aromatica、T.mechernichensis和T. terpenica等，而其中T. mechernichensis是一類典型的好氧反硝化菌;Dechloromonas菌屬具有良好的反硝化功能，主要功能菌D. agitate和D. denitrificans都具有較強的硝酸鹽還原能力[23].隨著季節的變化，僅Azohydromonas和Longilinea菌屬存在較大波動，但污泥微生物群落結構整體變化較小，使完全混合式曝氣系統始終保持良好的脫氮效能.完全混合式曝氣系統內污泥微生物多樣性豐富，為系統的高效脫氮奠定了基礎.具體參見污水寶商城資料或http://m.xhxdt.com更多相關技術文檔。
圖 8 系統中污泥微生物綱的分布比例
表 3 系統污泥微生物優勢菌屬及其比例/%
3 結論
(1) 采用完全混合曝氣系統處理污水，在無外加碳源的情況下，取得較好的有機物去除效果和脫氮效果，COD、NH4+-N和TN的去除率分別為93.2%、96.9%、75.2%，出水COD、NH4+-N和TN均優于一級A排放標準.
(2) 完全混合式曝氣系統中污泥在低DO濃度(0.1~0.2 mg·L-1)條件下具有較高的反硝化能力，其脫氮速率是污水處理廠污泥的2.86倍以上.當DO濃度大于1 mg·L-1時，系統污泥仍具有一定反硝化能力，其脫氮速率與污水處理廠污泥相當.
(3) 周質硝酸鹽還原酶亞基基因napA的PCR擴增結果表明，系統內存在一定濃度的好氧反硝化菌.系統內污泥微生物結構穩定，以變形菌綱為主，動膠菌屬(Zoogloea)，陶厄氏菌屬(Thauera)和Dechloromonas菌屬為優勢菌屬.
