污水處理廠對改善水環(huán)境狀況起到了重大作用，但污水處理廠的尾水出路問題一直未得到有效解決. 許多污水處理廠將尾水直接排入天然水體,巨大的排放量超過天然水體的水環(huán)境容量，加劇水環(huán)境的污染. 因此尾水問題引起了社會各界的廣泛關(guān)注，并對尾水深度處理及排放做了大量研究 [1,2]，生物濾池、 人工濕地等尾水深度處理技術(shù)以及高效尾水排放系統(tǒng)也應(yīng)運而生. 這些措施在一定程度上降低了尾水排放對自然水體的沖擊. 但是在人們關(guān)注尾水對自然水體水質(zhì)產(chǎn)生影響的同時，卻忽略了尾水中存在的大量微生物對自然水體生態(tài)平衡及附近人群可能造成的危害.
城市污水中含有大量的微生物，其中相當一部分為病原菌，如： 沙門氏菌(Salmonella spp.)、 志賀氏菌(Shigella spp.)、 大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、 霍亂弧菌(Vibrio cholerae)、 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、 弓形桿菌(Arcobacter spp.)等[3,4]，可對人身體健康和社會經(jīng)濟造成嚴重危害. 研究發(fā)現(xiàn)這些病原菌主要是人源污水微生物，污水處理工藝對其有一定去除效果[5]，消毒可使病原菌的數(shù)量大大降低[6]，但有些微生物生存能力強，能夠產(chǎn)生芽孢和孢子，難以徹底去除. 目前對城市污水的微生物學評價多采用細菌總數(shù)和總大腸桿菌數(shù)，但糞大腸菌群與其他尾水常見病原菌相關(guān)性較低，而不能有效代表全部的微生物或病原菌[7]. 國內(nèi)對尾水安全的研究起步較晚，主要集中于消毒、 尾水排放對受納水體影響和部分回用水的微生物安全研究[8, 9, 10]. 文獻[11,12]采用定量聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)(qPCR)建立了尾水中某些病原菌的定量檢測方法，證實了尾水中病原菌定量檢測的可行性. 但均未對尾水微生物的群落結(jié)構(gòu)進行詳細的分析.
傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法難以獲得尾水微生物群落結(jié)構(gòu)的準確信息[13]，隨著現(xiàn)代分子生物學的發(fā)展，出現(xiàn)了一些更快、 更準確分析微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的方法，這些方法突破了傳統(tǒng)研究方法要依賴于培養(yǎng)技術(shù)的局限而顯示出明顯的優(yōu)越性. 研究證實RFLP技術(shù)具有較高的分辨率和可重復(fù)性，已廣泛用于環(huán)境中微生物的群落結(jié)構(gòu)分析[14, 15, 16, 17, 18, 19]. 因此，本研究擬采用PCR-RLFP技術(shù)對青島市某污水處理廠待排尾水的微生物群落結(jié)構(gòu)進行分析，以期為尾水排放安全防范措施的提出提供依據(jù)，對于公共健康有著十分重要的意義. 1 材料與方法 1.1 主要試劑和儀器
試劑：土壤DNA提取試劑盒(OMEGA)，DNA凝膠回收試劑盒(OMEGA)，PCR mix，內(nèi)切酶，瓊脂糖，TAE緩沖液(50×). 儀器：PCR儀，凝膠成像系統(tǒng)(gene公司); 高速冷凍離心機，超凈工作臺，核酸超微量分析儀. 1.2 樣品采集
2013-06-10采用擊開式采水器采集青島市某污水處理廠待排尾水水樣，低溫保存并在2 h內(nèi)送至實驗室進行抽濾，抽濾后細菌用于基因組提取. 該污水處理廠以A2O工藝為主要處理工藝，采用次氯酸鈉消毒，日處理水量1.7×105 m3，其中60%為工業(yè)廢水，40%為生活污水. 進出水水質(zhì)指標如表 1.
表 1 污水廠進出水水質(zhì)指標
1.3 總DNA提取
采用土壤DNA提取試劑盒(OMEGA)的方法，獲得純度和含量較高的DNA模板，可進一步供PCR擴增使用. DNA檢測使用1%瓊脂糖進行水平電泳，在0.5 g ·mL-1的溴化乙錠溶液中染色30～45 min，用去離子水漂洗后紫外下觀察. 1.4 16S rDNA基因的PCR擴增
兩個引物用于擴增16S rRNA基因片斷，上游引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′) 和下游引物1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[20]. 通過低熔點瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR結(jié)果，使用Wizard DNA Clean-Up Kit (Promega)試劑盒回收目的片斷. 1.5 16S rDNA文庫的構(gòu)建與篩選
將純化后的DNA片段通過T4連接酶克隆試劑盒(MBI Fermentas)連接在Ptz57R/T載體上，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌(DH5α)細胞中，涂布于加有50 μg ·mL-1 Amp及IPTG、 X-gal的生色LB瓊脂平板上，放在37℃培養(yǎng)箱中正培養(yǎng)2 h，再倒置培養(yǎng)10~16 h，培養(yǎng)基平板上長出直徑3~5 mm的菌落. 隨機挑選平板中的200個陽性克隆子，采用菌體直接擴增方式，用pTZ57R/T Vector通用引物M13/PUCR 5′-3′:GTAAAAC GACGGCCAGT; M13/PUCF 5′-3′:CAGGAAACAGCTATGAC擴增外源插入片段，重新獲得目標基因. 1.6 陽性克隆子的PCR-RFLP分析
擴增產(chǎn)物用4堿基限制性內(nèi)切酶HhaI消化從各克隆子擴增出來的目標片段. 用3%瓊脂糖凝膠分離酶切片段，200 V下電泳2.5 h，用凝膠成像儀拍照，并對凝膠電泳圖譜進行分析，將每個酶切分型結(jié)果作為一個OTU(operational taxonomic unit). 1.7 測序和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹
選取PCR-RFLP篩選出的陽性克隆子，送上海生物工程公司進行序列測定. 測序所得16S rRNA序列，采用Blast軟件在GenBank進行相似性搜索(http://www. ncbi. nlm. nih. gov. blast)，獲取近似序列及對應(yīng)菌種信息. 用Clustal X程序進行比對，用鄰接法(Neighbor-joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹. 拓撲分析為1000次重復(fù)取樣結(jié)果，生成發(fā)育樹采用Treeview重建. 1.8 分析方法
(1)文庫的庫容(coverage)計算公式為：
式中，N代表 16S rDNA文庫總克隆數(shù)，nl代表在文庫中僅出現(xiàn)一次的OTUs(operational taxonomic units)的數(shù)量.
(2)Shannon-Wiene多樣性指數(shù)(H′)：
式中，S為16S rDNA的所有RFLP總類型數(shù)，ni為第i種16S rDNA的RFLP變異類型克隆數(shù)，N為總克隆數(shù).
(3)豐富度指數(shù) (Margalef)：
(4)均勻度指數(shù)的計算公式為：
2 結(jié)果與分析 2.1 基因提取及16S rDNA擴增
尾水化學組分復(fù)雜，能否成功提取目標DNA片段及提取效率的高低直接影響后續(xù)RFLP分析. 從樣品中提取的DNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢驗，得到一條清晰條帶，與細菌基因組的大小相同，因此所提DNA屬于比較完整的細菌基因組DNA. 且條帶的亮度和清晰度較好沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，說明DNA的純度較高，提取獲得了滿意的結(jié)果[21]. 經(jīng)PCR反應(yīng)，獲得了樣品中細菌16S rDNA的目的片段，長約1500 bp且亮度和純度都比較好，未出現(xiàn)非特異性擴增，且陰性對照未有產(chǎn)物出現(xiàn)，說明PCR擴增效果良好. 2.2 16S rDNA基因的PCR擴增
圖 1為克隆子擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖譜，從中可以看出，條帶長約1600 bp，亮度和純度都比較好，克隆率較高且未出現(xiàn)非特異性擴增，可以用于后續(xù)實驗.
1~61：可用于酶切的克隆子16S rDNA擴增片段 圖 1 部分克隆子16S rDNA擴增的瓊脂糖凝膠電泳圖譜
2.3 RFLP圖譜分析
從文庫中共挑取白色菌落200個，其中陽性克隆168個，陽性率83.3%. 陽性克隆子 M13 PUC引物的PCR產(chǎn)物HhaⅠ酶切圖譜如圖 2所示，用Quantity one凝膠分析軟件對RFLP圖譜分析表明，168個陽性克隆中存在59個不同類型的OTUs. 其中A33的OTU占7.14%，比例超過3%的OTUs一共有9種，僅有唯一克隆子的OUTs有18個. 該文庫的生物多樣性指數(shù)如表 2所示. 克隆文庫的覆蓋度(coverage value,C)體現(xiàn)樣品中微生物的覆蓋程度，其數(shù)值越大，所構(gòu)建的克隆文庫包含的樣品中的微生物種類就越多，因此越能真實地反映該樣品中微生物多樣性特征. 但是Kemp等[22]研究發(fā)現(xiàn)即使再大的克隆文庫都不能囊括環(huán)境樣品中的所有微生物，理論上來講，當覆蓋度超過80%即可認為該克隆文庫具有較高的庫容. 本研究中尾水克隆文庫庫容值C達到89.3%，表明所研究的克隆文庫庫容比較高，能真實地反映樣品中的細菌群落結(jié)構(gòu)組成. 豐富度指數(shù)(dMa)是與物種均勻度無關(guān)的多樣性指數(shù)，它僅與環(huán)境中物種數(shù)目的多寡有關(guān)，本研究中dMa為 11.3，說明本樣品中物種數(shù)量較多. 香農(nóng)多樣性指數(shù)(Shannon Diversity Index,H′)在均一度存在明顯差異的群體中存在一定的缺陷，即低豐富度和高均勻度的群落與具高豐富度和低均勻度的群落多樣性指數(shù)可能相同[23]，但對某一指定樣品卻是能反映豐富度和均勻度的綜合指標，本克隆文庫中H′為3.84，說明尾水中細菌豐富度和均勻度較高. 均勻度(species evenness,E)是指生境中全部物種個體數(shù)目的分配狀況，它反映的是各物種個體數(shù)目分配的均勻程度，本研究中尾水的均勻度指數(shù)為75%，說明尾水中細菌分布相對均勻，優(yōu)勢物種種類和數(shù)量不多.
圖 2 部分克隆子 M13 PUC引物的PCR產(chǎn)物HhaⅠ酶切圖譜
表 2 尾水克隆文庫多樣性指數(shù)
2.4 克隆子測序及系統(tǒng)發(fā)育學分析
對經(jīng)過RFLP分析獲得的59個克隆的插入序列進行序列測定. 一般來說，當微生物的16S rDNA同源性達到97%或以上時，可以將這些菌劃為一個種; 同源性達到94%或以上時，可以將這些菌劃為一個屬[24]. 因此采用BLAST軟件對所獲得克隆子序列與迄今已描述的原核生物16S rDNA 序列相似性進行了比對(表 3). 59個克隆子序列中僅有30個與已知物種相似度在94%以上，10種相似度低于90%，說明尾水中仍有許多未經(jīng)純培養(yǎng)得到分離鑒定的物種，因此對尾水的生物安全性認識也較為不足. 59個物種中，Legionella longbeachae占7.14%，具有一定優(yōu)勢，Pseudomonas kilonensis、Dechloromonas aromatica、Desulfococcus multivorans 所占比例均大于4%，也屬于相對優(yōu)勢物種.5個物種所占比例介于4% ~3%之間，6個物種所占比例介于3% ~2%，26個物種所占比例在2% ~1%之間，18個物種所占種比例均低于1%.
表 3 樣品中細菌16Sr DNA的BLAST分析結(jié)果
59種細菌分別屬于11個綱(圖 3). 44種細菌屬于變形菌門(Proteobacteria)約占85%，其中23種屬于β-變形菌綱占41.4%，10種屬于γ-變形菌綱占26.5%，α-變形菌綱有5種細菌，δ-變形菌綱有3種細菌，這一結(jié)果與尾水排放口附近的微生物群落結(jié)構(gòu)組成極為相似[25]，說明尾水對受納水體生物多樣性具有重要的影響. 7種細菌屬于Clostridia綱占7.2%，而Actinobacteria、 Bacteroidia、 Gloeobacteria、 Nitrospira、 Planctomycetacia 這5個綱的細菌所占數(shù)量都低于4%.
圖 3 尾水中不同綱細菌所占比例
3 討論
Legionella longbeachae最早是在1981年時從肺炎患者體內(nèi)分離到的一類革蘭氏陰性細菌，可引起肺炎[23]. 雖然已報道的幾例肺炎患者，都是直接與被Legionella longbeachae污染的土壤或者肥料接觸引起的，但是新的傳播載體有可能導致該傳染病的暴發(fā)[26]. 沿海城市尾水一般都會直接排入附近海域，雖然高鹽環(huán)境和光照具有一定的殺菌作用[7]，但是新的環(huán)境也有可能存在Legionella longbeachae的新傳播載體. 尾水中除了Legionella longbeachae，還存在Legionella rubrilucens、 Legionella impletisoli，致使Legionella spp.所占比例超過10%，由于污水處理廠巨大的排放量，Legionella spp.引發(fā)的退伍軍人癥將會對附近人群健康產(chǎn)生潛在的巨大威脅.
尾水中Pseudomonas kilonensis、 Dechloromonas aromatica、 Desulfococcus multivorans、 Azospira restricta、 Denitratisoma oestradiolicum、 Massilia aurea、 Ralstonia eutropha、 Tistrella mobilis所占比例均超過3%，這8類細菌均在水處理系統(tǒng)中起著重要的作用并占一定的比例[27]，例如：Azospira restricta 具有氧化催化能力，能積累PHA，兼具脫氮除磷的作用，是一種典型的反消化除磷菌; Hydrogenophaga defluvi有厭氧消化能力，在水處理脫氮過程中有重要的作用，它還能利用有機酸、 氨基酸和蛋白胨等含氮化合物，但是對糖類的利用能力較低; Dechloromonas aromatic 可以代謝苯，同時利用碳源作為電子受體，因此在脫氮除磷中起著非常重要的作用. 由此可見水處理微生物對尾水微生物群落結(jié)構(gòu)有重要的影響，而水處理微生物的種類除受進水水質(zhì)影響外，主要取決于污水處理工藝，不同的污水處理工藝會導致水處理系統(tǒng)微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，因此各城市污水處理廠應(yīng)該根據(jù)受納水體的特點和凈化能力選擇適合的污水處理工藝.
為降低尾水中細菌尤其是致病菌的數(shù)量，在其排入自然水體前通常要進行消毒后處理，常用的消毒方式主要有紫外、 氯氣和臭氧，消毒后尾水中微生物的數(shù)量大大降低(99.9%)，但有些微生物生存能力強，難以徹底去除[7]. 本研究發(fā)現(xiàn)尾水中含有4%以上的 Dechloromonas aromatic，該菌有次氯酸鹽歧化酶和血紅素加氧酶，前者能迅速地將次氯酸鹽(ClO-)分解成氯離子(Cl-)和氧氣，后者能以次氯酸鹽(ClO-)作為氧化劑參加氧化還原反應(yīng)[24]，因此它具有一定的代謝次氯酸鹽的能力，這可能是Dechloromonas aromatic在尾水中有較大比例的一個重要原因. 這也提示污水處理廠在選擇消毒工藝時使用不同工藝的組合可大大提高尾水中微生物的除去效果. 糞大腸桿菌、 大腸埃希氏菌、 沙門氏菌、 志賀菌屬、 霍亂弧菌等致病菌均未檢出，這主要是因為這些細菌數(shù)量較少所占比例較低，而本研究所建的克隆文庫不夠大所致，因此有對這些致病菌進行研究需要選擇更加針對性的研究方法進行檢測.
為保護重點湖泊、 水庫、 河段，世界不少沿海國家和地區(qū)常常將尾水調(diào)離敏感水域，集中輸送至海洋進行最終處置[28]. 目前尾水排海主要有深海排放和近岸直排兩種方式，深海排放對環(huán)境影響較小，但深海排污工程造價高，一般為發(fā)達國家或者發(fā)展中國家的特定地區(qū)所采用. 目前我國大部分沿海地區(qū)一般在尾水達到一級A或者B標準后采用近岸直排的方式. 近岸水深較淺，流速較慢，再加上排海尾水量日益增加，致使微生物尤其是病原微生物難以得到較快的輸送和消滅而被聚集在近岸海域[22]，本研究發(fā)現(xiàn)尾水中存在的大量Legionella spp.，其引起的疾病可能會對排水口附近海水浴場人群的健康造成威脅. 同時尾水中含有超過50種微生物，大量異源微生物入侵海洋也會影響海洋生態(tài)環(huán)境，造成海水養(yǎng)殖損失，因此尾水的處置不容忽視.具體參見污水寶商城資料或http://m.xhxdt.com更多相關(guān)技術(shù)文檔。
4 結(jié)論
(1)尾水中含有59種細菌分別屬于11個綱，其中 44種細菌屬于變形菌門(Proteobacteria)約占85%(β-變形菌綱和γ-變形菌綱占絕對優(yōu)勢)，7種細菌屬于Clostridia綱占7.2%，而Actinobacteria、 Bacteroidia、 Gloeobacteria、 Nitrospira、 Planctomycetacia 這5個綱的細菌所占數(shù)量都低于4%. 這些微生物大多來源于污水處理過程，因此各地區(qū)應(yīng)該根據(jù)受納水體的特點和凈化能力選擇合適的污水處理工藝.
(2) 尾水的59種細菌中Legionella spp.占10%以上，其導致的退伍軍人癥可能成為尾水排放對附近人群健康的最大威脅; 另外一些細菌能代謝次氯酸鹽對氯氣有一定抵抗能力，所以在選擇消毒措施時應(yīng)該選用氯氣消毒與其他消毒工藝的組合. 本研究中糞大腸桿菌、 大腸埃希氏菌、 沙門氏菌、 志賀菌屬、 霍亂弧菌等致病菌在尾水中均未檢出，因此對這些致病菌進行研究需要選擇針對性更強的方法.(來源及作者：青島理工大學環(huán)境與市政學院 徐愛玲、任杰、宋志文、吳等等、夏巖)
